RNAi在成体干细胞分化的研究进展

项 炜，安荣泽，王兆杰 [遵义医学院第五附属（珠海）医院骨外科，广东 珠海 519000]

RNAi（RNA interference）是普遍存在于自然界中的基因沉默现象，是近些年才发现并迅速发展起来的一门新兴的基因阻断技术，RNAi是一种强有效的抑制基因表达的工具，以高度特异性、高效性、作用迅速以及操作简单等特点受到分子生物学研究者们青睐，该技术由Andrew Fire和Craig Mello在秀丽新小杆线虫中发现，已广泛应用于基因功能的研究、抗肿瘤以及各种疾病的研究中[1]。

1 成体干细胞

成体干细胞是一种具有自我更新、不断增殖和组织特异性定向分化潜能的一类细胞，曾认为其再生和分化潜能是比较局限的，然而当成体干细胞的“可塑性”被提出后，这种潜能低的观点受到抨击。Blau表明扩展成体干细胞的传统概念是必要的，他们提出成体干细胞的新概念，认为成体干细胞存在于不同类型的组织中，是一种细胞状态，而且可以通过血液循环到达机体各处，参与组织的修复和再生[2]。目前发现的成体干细胞主要有造血干细胞、神经干细胞和间充质干细胞。另外还有肝脏干细胞，毛囊来源性干细胞、牙髓干细胞等[3-4]。

2 RNAi在成体干细胞中的应用

近些年，RNAi高效、特异的基因沉默作用，激发了科研工作者们对其应用前景的探索。目前该技术在细胞水平上的研究已取得了巨大成功，在成体干细胞方面也有许多成功的试验。Low等指出在生物医学中，引导或促进干细胞分化方面，RNAi是一种重要技术手段[5]。

3 RNAi在造血干细胞中的应用

造血干细胞（Hematopoietic Stem Cells，HSCs）是造血细胞的“种子”，体内所有的血细胞都由它分化而来。存在于骨髓外周血脐带血中，可以转变成肝细胞、神经细胞，或在肌肉组织中分化为有成熟肌肉细胞表型的细胞等，还可随血液流动进入全身各个组织中补充各种组织中成体细胞的不足，HSCs又是一个基因治疗的理想靶细胞[6]。

随着HSCs分离、纯化和体外培养技术的日趋成熟，以HSCs为靶细胞的基因转移已成为基因功能研究的一个重要领域。Gupta构建了以病毒为载体，带有绿色荧光蛋白（GFP），用以沉默人肾母细胞过度表达基因序列（Nephroblastoma Overexpressed，Nov/CCN3）的短发夹RNA（shRNA），在转染至HSCs后第7天，通过RT-PCR检测发现Nov/CCN3表达明显减少，HSCs在体内外的功能均丧失[7]；然而，加强Nov/CCN3基因表达却可增强HSCs增值分化的活性，以此实验证明了Nov/CCN3基因是HSCs增值分化关键的调节基因。为了提高HSCs的细胞转染率，许多学者在载体方面做研究，Papadaki首次以泡沫病毒（Foamy virus，FV）为载体，将带有小鼠mU6和人类H1聚合酶Ⅲ启动子的序列在体外分别转染到人和小鼠的HSCs中，经骨髓移植至小鼠体内进行观察，两者均十分有效地沉默了目的基因，并表明FV作为载体在HSCs中高转染率及其高度稳定性[8]。Martino实验表明，HSCs在定向分化成树突状细胞时，运用RNAi技术，通过阳离子脂质体DOTAP转染法沉默组织蛋白酶S基因（Cathepsin S，CatS），可影响HSCs成树突状细胞的转化，而且具有转染率高，毒性比病毒载体低的优点[9]。

4 RNAi在神经干细胞中的应用

神经干细胞（Neural Stem Cells，NSCs）是一类具有分裂潜能和自我更新能力的母细胞，它可以通过不对等的分裂方式产生神经组织的各类细胞，NSCs的发现打破了神经元不会再生的传统观念。近年来人们对多种神经系统疾病的相关基因基础有了新的认识，NSCs的临床应用与基因治疗的有机结合，为多种神经系统遗传性和获得性疾病的治疗开辟了一条崭新的途径[10]。

NSCs可在体外培养且根据不同需要导入外源基因，是一种广谱的细胞载体，细胞的转染均存在转染率的问题，而干细胞更是比较难转染的细胞之一，构建高转染率载体是必要的，张蓬勃构建针对小鼠低氧诱导因子-1α基因（HIF-1α）的siRNA腺病毒载体AdHIF-1α-shRNA-EGFP，体外转染培养的小鼠前脑皮质NSCs，实验证明腺病毒载体能较高效率地转染小鼠胚胎NSCs并能有效抑制低氧条件下HIF-1α的表达[11]。学者们以RNAi技术基因沉默NSCs的相关基因，观察基因沉默后对NSCs分化方面的影响也进行了研究。王东等在颅脑损伤的研究中表明，通过RNAi技术，暂时性封闭NSCs中的NgR基因，再通过立体定向的方法准确移植到大鼠颅脑损伤区，移植的NSCs可以更好的在损伤部位存活，增殖分化与迁移，促进脑外伤后大鼠神经功能的恢复[12]。有学者发现，通过构建siRNA沉默NSCs中的RE1沉默转录因子（REST），调整REST水平，不仅可以控制NSCs的分化，而且可以使得一些涉及复杂分子机制的神经细胞功能被激活，如神经轴突的生长等[5]。

5 RNAi在间充质干细胞中的应用

间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells，MSCs）是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层。MSCs最早在骨髓中发现，随后还发现存在于人体发生、发育过程的许多种组织中。目前，我们能够从骨髓、脂肪、滑膜、骨骼、肌肉、肺、肝、胰腺等组织以及羊水、脐带血中分离和制备间充质干细胞。

RNAi技术应用于MSCs的相关研究较多。Suehiro等利用相关的siRNA分别沉默MSCs中的ZHX3，RUNX2和Osterix基因，对比三者间影响MSCs的成骨能力，实验表明ZHX3基因在MSCs成骨细胞分化能力可与RUNX2和Osterix基因相媲美，以此推断ZHX3是MSCs成骨分化的关键因子[13]。有研究显示，通过脂质体法将PTEN基因特异的siRNA转染入骨髓来源的间充质干细胞（BMSCs），PTEN基因的沉默能有效地促进BMSCs的增殖，使细胞周期向右偏移，同时能抑制细胞凋亡，增强细胞对缺血缺氧的耐受能力[14]。体内实验也证实，PTEN基因沉默后的BMSCs更容易在心肌梗死区域存活和增殖，为干细胞移植治疗心肌梗死提供新的思路。我国在胎盘和脐带来源的MSCs方面研究在世界上处于前列，陈奎通过RNAi技术下调人脐带间充质干细胞（hUCMSCs）中HLA-A2基因表达，可能是RNAi的高特异性和靶序列的选择性，siRNA只特异地沉默了其相应靶基因的表达，发现HLA-A2基因的沉默并不影响hUCMSCs成骨细胞的分化[15]。

6 展望

成体干细胞在特定的环境或诱导作用下分化产生新的目的细胞，不存在道德问题，将成为医学研究中首选的种子细胞，但成体干细胞向多种组织分化用于治疗的路程可能还很漫长，而RNAi技术具有巨大的应用前景，通过成体干细胞和RNAi技术两者的相结合，研究决定细胞发育特定基因的功能，通过沉默目的基因，进行细胞干预和基因调控，可暂时性抑制细胞内某段基因而不是永久敲除，为成体干细胞研究的可操作性提供一个完美的技术手段。利用RNAi技术特异性抑制成体干细胞维持或定向分化研究，对进行疾病治疗具有重要的现实意义。

目前，RNAi和成体干细胞研究尚处于初级阶段，但两者的结合已显示出巨大的应用潜力。总之，RNAi的应用将为成体干细胞研究开辟一条全新的途径。

[1] Mello CC,Conte DJ.Revealing the world of RNA interference[J].Nature,2004,431(7006):338.

[2] Blau HM,Brazelton TR,Weimann JM.The evolving concept of a stem cell:entity or function[J].Cell,2001,105(7):829.

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[13] Suehiro F,Nishimura M,Kawamoto T,et al.Impact of zinc fi ngers and homeoboxes 3 on the regulation of mesenchymal stem cell osteogenic differentiation[J].Stem Cells Dev,2011,20(9):1539.

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[15] 陈 奎,秦书俭.siRNA沉默HLA-A2基因表达对人脐带间充质干细胞诱导成骨的影响[J].解剖科学进展,2010,16(5):413.