黑龙江省链格孢属病原菌的RAPD分析

姚亮亮，丁俊杰，张铉哲，顾鑫，杨晓贺，赵海红，申宏波，刘伟

（1.农业部佳木斯作物有害生物科学观测实验站，黑龙江省农业科学院佳木斯分院，黑龙江佳木斯154007；2.东北农业大学农学院，黑龙江哈尔滨150030；3.黑龙江农业职业技术学院，黑龙江佳木斯154007）

黑龙江省链格孢属病原菌的RAPD分析

姚亮亮1，丁俊杰1，张铉哲2*，顾鑫1，杨晓贺1，赵海红1，申宏波3，刘伟1

（1.农业部佳木斯作物有害生物科学观测实验站，黑龙江省农业科学院佳木斯分院，黑龙江佳木斯154007；2.东北农业大学农学院，黑龙江哈尔滨150030；3.黑龙江农业职业技术学院，黑龙江佳木斯154007）

利用RAPD技术分别对分离自黑龙江省各地区的90株链格孢属病原菌进行了遗传多样性分析。利用NTSYS 2.0进行链格孢属病原菌的聚类分析。RAPD分析结果表明，引物OPE-19扩增后产生的各个群体间相似性系数分布在0.60～1.00。在68.0%相似性水平上可划分为3个主要RAPD组群和8个次要RAPD组群。聚类分析结果表明，黑龙江省链格孢属病原菌RAPD组群与寄主植物和分离地区之间没有相关性。

链格孢属病原菌；RAPD；马铃薯早疫病菌

链格孢属（Alternaria Nees）病原菌属于半知菌亚门丝孢纲丛梗孢目黑色菌科，是农作物的主要致病菌之一，在全球分布非常广泛。全世界已描述的近500个链格孢属病原菌的种分类单位中95%以上链格孢属病原菌可兼性寄生于植物，引起农作物病害[1]。链格孢属病原菌中存在着丰富的遗传多样性。Welsh和Mcclelland[2]采用随机扩增多态性DNA（Random amplified polymorphic DNA，RAPD）技术，用5个RAPD随机引物扩增了35个A.solani和A.alternata菌株的基因组DNA，通过聚类分析，两个种之间有明显的区别，但每个种内的相似性大小与地理来源、寄主和致病性强弱关系不大。孙霞[3]筛选出的9个随机引物对57个链格孢属病原菌进行RAPD分析，共得到142个多态性带，平均每个引物15.8条带。聚类结果显示，大孢子种和小孢子种能明确区分成两组群。RAPD被广泛应用于链格孢属病原菌遗传多样性研究中，但在国内还未见同时对A.solani，A.porri及A.brassicola进行遗传多样性分析。为了了解黑龙江省A.solani，A.brassicola及A. porri的遗传结构，从而达到科学监测A.solani，A. brassicola及A.porri菌群结构动态变化的目的。本研究将利用RAPD分子标记测定3种链格孢属病原菌的遗传多样性，为A.solani，A.porri及A.brassicola群体遗传变异的研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

链格孢属病原菌的采集∶2007～2009年在黑龙江省哈尔滨市、齐齐哈尔市、牡丹江市、鹤岗市、佳木斯市和加格达奇市6个地区采集分别被A.solani侵染的马铃薯叶片，被A.porri侵染的大葱叶片及被A.brassicola侵染的甘蓝叶片。切成小片，用70%酒精清洗3～5 s，10%升汞清洗1～2 min，用灭菌过的滤纸吸干。在25℃下放到PDA培养基上恒温培养，收集菌丝，转到PDA斜面上于-20℃保藏。

1.2 方法

1.2.1 提取DNA

采用Goodwin等[4]的方法提取基因组DNA。

1.2.2 DNA浓度与纯度的检测

利用紫外分光光度法将保存的DNA溶液用超纯水稀释一定倍数，测定其A260和A280，DNA纯度依据A260∕A280判定，比值在1.8以上的DNA符合要求。

1.2.3 RAPD分子标记

选用OPE的1组共20个寡聚核苷酸引物（表1），分别扩增从马铃薯上分离的8个链格孢属病原菌，根据扩增结果，从中筛选出扩增条带多、清晰且重复性、差异性好的4个引物。

表1 试验使用的RAPD引物序列Table 1 Oligonucleotide RAPD primers used in experiment

1.3 数据统计与分析

对琼脂糖凝胶电泳图谱及聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱进行统计。将电泳图谱上清晰且可重复出现的条带记为“1”，同一位置没有条带记为“0”，同时忽略条带强弱的差异，生成“0”和“1”组成的原始矩阵。统计各引物的位点。利用NTSYSpc 2.1软件进行数据处理，使用SAHN程序进行聚类分析，采用UPGMA法（Unweighted pair-group method arithmetic averages，非加权配对算术平均法）进行聚类分析，并通过Tree plot模块生成聚类图（Phenogram）。

2 结果与分析

在20个OPE引物中OPE-4、OPE-11、OPE-19、OPE-20扩增效果较好，其中OPE-19扩增的条带清晰、条带数多，而且特异性条带数最多（图1）。因此，本研究利用OPE-19引物扩增了90个链格孢属病原菌，并分析链格孢属病原菌的遗传多样性。

图1 不同RAPD引物扩增8个链格孢菌的基因组DNA的图谱Figure 1 RAPD profiles of eight Alternaria isolates genomic DNAs amplified by using different RAPD primers

为了分析链格孢属病原菌的遗传多样性，本试验利用OPE-19引物扩增了90株链格孢属病原菌的基因组DNA。根据OPE-19电泳图谱中扩增条带的有无，对DNA扩增条带进行统计。OPE-19对90个不同链格孢属病原菌的扩增结果显示共扩增出18条条带，其中差异性片段是11条。利用NTSYS分析表明，在被测定的所有链格孢属病原菌中由OPE-19引物扩增后产生的各个群体间相似性系数分布在0.560～1.000之间。RAPD分析结果显示，在68.0%相似性水平上可划分为3个主要RAPD组群和8个次要RAPD组群（图2）。

3个主要RAPD组群RG1、RG3和RG5分别是由16个菌株、18个菌株和16个菌株组成的。在11个RAPD组群中，同时含有3种链格孢属病原菌的组群有3个，RG1组群由哈尔滨市分离的芸苔链格孢菌（6个）和葱链格孢菌（1个），以及加格达奇市（1个）、佳木斯市（3个）、牡丹江市（1个）和齐齐哈尔市（4个）分离的茄链格孢菌组成；RG3组群由哈尔滨市分离的芸薹链格孢菌（3个）和葱链格孢菌（3个），以及佳木斯市（1个）、牡丹江市（4个）、齐齐哈尔市（6个）和鹤岗市（1个）分离的茄链格孢菌组成；RG11组群由哈尔滨市分离的芸苔链格孢菌（3个）和葱链格孢菌（3个），以及齐齐哈尔市分离的茄链格孢菌（2个）组成；RG5组群由哈尔滨市分离的芸苔链格孢菌（2个），以及哈尔滨市（1个）、牡丹江市（5个）、齐齐哈尔市（7个）和鹤岗市（1个）分离的茄链格孢菌组成；RG6组群由哈尔滨市分离的葱链格孢菌（1个）和牡丹江市分离的茄链格孢菌（1个）组成；RG7组群由哈尔滨市分离的葱链格孢菌（2个）和佳木斯市（1个）、牡丹江市（1个）和齐齐哈尔市（1个）分离的茄链格孢菌组成；RG8组群由哈尔滨市分离的葱链格孢菌（2个）和佳木斯市（1个）、牡丹江市（2个）和齐齐哈尔市（4个）分离的茄链格孢菌组成；RG2组群由佳木斯市（2个）、牡丹江市（1个）和齐齐哈尔市（2个）分离的茄链格孢菌组成；RG8组群由哈尔滨市（1个）、牡丹江市（2个）和齐齐哈尔市（6个）分离的茄链格孢菌组成；RG4只包含一个佳木斯分离的茄链格孢菌；RG10只包含一个哈尔滨市分离的葱链格孢菌。以上结果说明RAPD组群与寄主植物和分离地区之间没有相关性。

图2 黑龙江省各地区和不同寄主植物上分离的90个不同的链格孢属病原菌基于RAPD（引物OPE-19）DNA指纹的的聚类分析Figure 2 Dendrograms of 90 Alternaria pathogen isolates collected from different locations and host plants based on RAPD（primer OPE-19）DNA fingerprints in Heilongjiang

3 讨论

本研究利用RAPD技术分析了采自黑龙江省6个地区的不同寄主上分离的90个链格孢属病原菌的遗传多样性，比较了RAPD图谱遗传多态性与寄主植物和孢子类型之间的相关性。Mahuku等[5]的研究结果显示，RAPD标记对基因组学提供有用信息。因为RAPD无论在启动位点内或启动位点之间能检测到基于碱基序列的变化，包括插入、缺失、置换和倒置。RAPD分析结果表明，3种链格孢种A.solani，A.brassicola及A.porri的种间亲缘关系很近，但是在种内存在着明显的变异。A.solani分布在10个RAPD组群上；A.brassicola分布在4个RAPD组群上；A.porri分布在7个RAPD组群上。以上结果表明链格孢菌属真菌具有丰富的遗传多样性。聚类分析图中可以看出，A.solani，A.brassicola及A.porri同时分布在一个RAPD组群上，因此仅靠RAPD标记并不能区分3种链格孢属病原菌。这些结果与王洪凯等[6]以及Roberts等[7]的研究结果一致。

RAPD分析结果显示，在68.0%相似性水平上可划分为3个主要组群和8个次要组群（图2）。结果还显示，牡丹江市和齐齐哈尔市分离的马铃薯早疫病菌分别划分为8个RAPD组群。Goodwin[8]报道，遗传多样性最多的地区是病菌起源中心。根据这一结论，我们初步推测黑龙江省马铃薯早疫病可能是由牡丹江和齐齐哈尔地区为起源中心开始扩散。

[1]方中达.植病研究方法[M].北京:中国农业出版社,2007.

[2]Welsh J,Mcclelland M.Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers[J].Nucleic Acids Research,1990,18(24): 7213-7218.

[3]孙霞.链格孢属真菌现代分类方法研究[D].山东农业大学,2006.

[4]Goodwin S B,Drenth A,Fry W E.Cloning and genetic analyses of two highly polymorphic,moderately repetitive nuclear DNAs from Phytophthora infestans[J].Current Genetics,1992,22:107-115.

[5]Mahuku G,Peters R D,Platt H W,et al.Random amplified polymorphic DNA(RAPD)analysis of Phytophthora infestans isolates collected in Canada during 1994 to 1996[J].Plant Pathology,2000,49(2):252-260.

[6]王洪凯,张天宇,张猛.链格孢属真菌分类研究进展[J].山东农业大学学报,2001,32(3):406-410.

[7]Roberts R G,Reymond S T,Anderson B.RAPD fragment pattern analysis and morphological segregation of small-spored Alternaria species and species group[J].Mycological Research,2000,104 (2):151-160.

[8]Goodwin S B.The population genetics of Phytophthora[J]. Phytopathology,1997,87:462-473.

RAPD Analysis of Alternaria Pathogens in Heilongjiang Province

YAO Liangliang1，DING Junjie1，ZHANG Xuanzhe2＊，GU Xin1，YANG Xiaohe1，ZHAO Haihong1，SHEN Hongbo3，LIU Wei1
(1.Observation and Experiment Station of Crop Pests of Jiamusi,Ministry of Agriculture/Jiamusi Branch of Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences,Jiamusi,Heilongjiang 154007,China;2.College of Agronomy,Northeast Agricultural University,Harbin, Heilongjiang 150030,China;3.Heilongjiang Agricultural College of Vocational Technology,Jiamusi,Heilongjiang 154007,China)

To understand the genetic diversity of 90 Alternaria pathogen isolates collected from Heilongjiang Province, the genotypic characteristics was performed by using random amplified polymorphic DNA(RAPD),and cluster analysis of Alternaria pathogens was carried out by using NTSYs program.RAPD results indicated that the similarity coefficients of RAPD group amplified by the primer OPE-19 ranged from 0.60 to 1.00.According to RAPD analysis by using the primer OPE-19,90isolateswereseparatedintothreemajorRAPDgroupsandeightminorgroupsatthesimilaritylevelof68.0%.The cluster analysis results suggested that RAPD groups not be correlated with the host plants and locations where the isolates werecollected.

Alternaria pathogens；RAPD；Alternaria solani

S532

B

1672－3635（2013）06-0365-05

2013-11-28

国家农业部948项目“马铃薯地上垄体栽培模式配套与示范”（2011-Z52）。

姚亮亮（1985-），男，硕士，实习研究员，主要从事作物病害及综合防治技术研究。

张铉哲，教授，主要从事作物病害及综合防治技术研究，E-mail∶zhe3850@yahoo.com.cn。