酶定向进化技术研究进展

李珍华，章志量，方秀娟，李燕琼，石陆娥

(杭州师范大学生命与环境科学学院，浙江 杭州 310036)

酶定向进化技术研究进展

李珍华，章志量，方秀娟，李燕琼，石陆娥

(杭州师范大学生命与环境科学学院，浙江 杭州 310036)

酶定向进化是模拟自然进化过程、用于改造酶性质的一种新策略.在以易错PCR为代表的无性进化技术基础之上，有性进化技术的发展使酶定向进化更接近于自然进化过程.与此同时为解决巨大容量的突变文库与有限的筛选技术之间的矛盾，许多新的高通量筛选方法不断涌现，大大加快了酶定向进化技术的发展.文章从构建高质量的突变基因文库和选择有效的高通量筛选方法两方面，详细总结了近几年出现的新技术并对其应用情况进行介绍.

酶定向进化；突变基因文库；高通量筛选方法

随着生物催化剂在医药、农业、食品、化工、环境保护等领域的广泛使用,定向进化技术也在不断成熟.酶作为最主要的生物催化剂，其定向进化技术已被用来改造更广范围的酶分子，六大类酶(氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶、连接酶)分别通过定向进化技术在性质方面得到很大的改善，以更好地应用到工业生产上[1].然而，定向进化技术的发展，关键是构建质量高的突变基因文库和采用有效的高通量筛选方法.本文主要就近几年这两方面的技术发展及应用做一详细介绍.

1 突变基因文库的构建

1.1 无性进化技术

1.1.1 传统方法及近期应用实例

易错PCR(error-prone PCR)是在PCR技术的基础上，通过改变反应条件，增加碱基错配率，从而向目的基因中引入随机突变的一种快速、简便的无性进化技术.该技术由Leung等[2]于1989年首次设计并报道、并由Cadwell等[3]对其进行了完善，是最早出现并实际应用的构建突变文库的方法，在近几年应用仍很广泛.通过该项技术，很多酶分子的性质得到了提高.如Trevizano等[4]利用易错PCR技术对来源于Orpinomycesstrain PC-2的内-β-1,4-木聚糖酶进行改造，以提高热稳定性.实验最终获得4株突变体M1, M2, M3和M4，60 ℃时的半衰期分别为209, 33.2, 401 和 15.3 min，而野生型在60 ℃的半衰期仅为7.92 min，此外，M3 和 M4在极端pH环境下也具有很好的稳定性.Yu等[5]采用该技术对在几丁质的生物治疗方面有重要作用的内切几丁质酶进行了成功的改造，实验获得的突变株MECH-Y185/S226对4-硝基苯基-N-乙酰基-β-d-氨基葡萄糖苷的催化活性提高了1.8倍，对胶体几丁质的催化活性提高了3.5倍，同时纯化的Ech42-Y185/S226具有了更高的热稳定性和更广的pH稳定性.

1.1.2 新方法

随着易错PCR技术的广泛应用，新的无性进化技术也在不断涌现.

Wong等[6]于2004年首次提出序列饱和突变法(SeSaM)，这是一种针对单链DNA进行突变的新技术，基本原理是在PCR扩增中，通过dNTP与事先借助单链DNA在全长基因中添加的通用次黄嘌呤脱氧核糖核苷酸(I)的交换达到突变目的.此方法与易错PCR相比，能较好地克服DNA聚合酶的碱基偏爱性，且突变效率高，缺点是操作较繁琐、试验周期长、使用药品多、费用较贵[7].

Jones[8]于2005年首次提出三核苷酸突变法(TriNex)，这是一种不依赖PCR的新技术，基本原理是首先利用转座子MuDel的随机插入切除原始目的基因的三核苷酸，再用连接酶把SubSeqNNN(DNA盒)插入到切除位置，引入新的三核苷酸，达到构建突变文库的目的.据Baldwin等[9]报道，该技术已在成功编码TEM-1β-内酰胺酶的bla基因中得到证实，并呈现了明显的优势，与易错PCR相比，克服了其碱基偏爱性和突变文库大、难筛选的缺点，而且由于它基于三核苷酸删除与替代的原理，最终也不会造成目的基因的移码。

Reetz等[10]于2007首次提出迭代饱和突变(ISM)，该方法结合了理性设计与随机突变，以蛋白质的空间结构为基础，依据待提高的酶学活性，选择关键的突变点或区域，进行反复饱和突变，最终筛选出目的突变株.在实际应用中已被证实比传统的易错PCR、在活性位点处的饱和突变或DNA改组方法更有效[11]，并被用来提高脂肪酶的立体选择性和热稳定性[12-14]或者蛋白质配体的特异性[15].

1.2 有性进化技术

1.2.1 传统方法及近期应用实例

DNA改组(DNA shuffling)与基因家族改组(DNA Family shuffling)是用重组的方法将2种以上同源正突变基因序列(或天然存在的基因家族)重新排布而引起基因突变的有性进化技术，由Stemmer等[16-17]首次提出并成功运用.而Zhao等基于以上原理提出了改进方法，即交错延伸重组(Staggered Extension Process, StEP)[18]和随机引物体外重组(Random-priminginvitrorecombination,RPR)[19]技术.对于易错PCR，有性进化技术可以说是一次成功的飞跃，能将两个或多个父本基因的优良性状加以组合，从而构建出更多样性的突变文库，在实际应用中常与易错PCR技术结合使用.例如，为了提高根霉菌脂肪酶的性质，Niu等[20]同时采用易错PCR和DNA shuffling技术对脂肪酶进行突变，最终筛选得到的突变株与野生株相比，最适温度提高了10 ℃，在50 ℃时的半衰期提高了12倍.对其突变氨基酸进行分析，发现第190位缬氨酸替代谷氨酸是导致该脂肪酶最适温度和热稳定性提高的一个关键因素.

1.2.2 新方法

同源改组是一类只能对同源性较高的序列进行重组的技术.传统有性进化技术均属于这一类，在此思想基础上，近些年一些新的技术层出不穷.

临时模板随机嵌合技术(RACHITT)[21]是将随机切割的基因片段与临时模板(另一种或属的亲本基因)杂交，在退火延伸阶段引入错配或叠交，最终形成嵌合基因.用该方法得到的嵌合体文库，平均每个基因含有14个交叉，重组效率比目前其它重组方法高出几倍.

随机片段交换法(RAISE)是Fujii等[22]于2006年首次提出的.该方法操作简便，仅由3步组成，即DNA破碎、添加随机短序列和重组.由于突变片段长度可以从1个变化到多个氨基酸，所以与传统突变方法相比，其最大的优势在于增强了突变文库的多样性，如碱基插入、缺失、替换等.

单链DNA介导的家族改组是Kikuchi等[23]建立的，并应用单链模板成功对家族基因nahH和xylE进行了重组，解决了双链DNA家族改组中同质双链高概率形成的问题.实验中，Kikuchi等首先用传统DNA家族改组中的DNaseI酶切，发现nahH和xylE的重组效率不到1%,而改用单链DNA家族改组中的限制酶切，并以单链DNA作为模板，nahH和xylE的重组效率接近100%.由此看出，单链DNA家族改组可以显著促进基因嵌合体的形成,效率更高，潜力更大.

与同源改组相对，非同源重组则可以在一些同源性较低的序列间进行重组.如Ostermeier等[24]提出的渐增切割法产生杂合酶(SCRATCHY)技术，其基本原理是用核酸外切酶III 代替DNaseI对靶序列进行切割，由于其5’- 3’ 外切核酸酶的作用，因此得到的递增截短片段库理论上包括了靶序列DNA单碱基对删除的各种情况, 使得在较低的复性温度下,可实现非同源区的融合[25].该技术的优点是可以在无同源性或低同源性的两个基因间产生重组，缺点是重组一定是在两个不同的父本之间产生，并且子代中功能杂合子的比率很低[26].

2 高通量筛选方法

构建突变基因文库的方法目前已经很多,但是定向进化成功与否的另一个关键因素是采用高通量的筛选方法,也就是根据突变酶的某种特征或固有性质，控制实验条件，从构建好的突变文库中筛选出目标酶.以下简单介绍3种常用的筛选方法：平板筛选、荧光筛选、表面展示技术.

2.1 平板筛选

平板筛选主要是依据细胞的表型，将含有随机突变基因的重组细胞从平板培养基上筛选出来.该方法简便、快速、直观，得到了广泛的应用.根据细胞表型的多样性，可以从多个方面筛选突变基因：例如逐步改变重组细胞生长的环境，依据细胞的耐受情况，可以筛选出一些对热、pH、抗生素、极端环境等耐受性提高的突变酶；也可以将突变酶作用的底物加入平板培养基中，依据最终形成的透明圈的大小来筛选活力提高的酶，或者利用营养缺陷株作为宿主菌，根据菌株的生长情况对突变酶进行筛选；此外，通过颜色的变化排除无效重组细胞，也可以筛选高活力的突变酶.pH指示剂法即是一例，它经常用于检测酯酶，以酚红为指示剂，随着酶催化酯类水解产生酸，通过体系中pH改变导致的颜色变化，就可以初步测定酶的活性[27].

2.2 荧光筛选

经典的荧光筛选大多是结合酶的荧光底物或产物，有时也用一种荧光物质作为指示剂或报告物质，随着反应的进行，通过荧光强度的变化鉴定酶的活性.这种方法经常结合微孔板(如96孔或384孔)进行，存在一些不足，如过分依赖人力、筛选通量较低[20]等，这就限制了新酶定向进化研究的进展.

令人欣慰的是，近年来随着人们对流式细胞仪的了解及广泛应用，基于它快速、高通量的筛选特点，一些新的荧光筛选方法正应运而生.如荧光激活细胞分选(FACS)[28]，首先将酶活性转化为可检测的荧光信号，并与酶所在的细胞构建联系，从而实现酶活性与细胞荧光强度的偶联.然后利用流式细胞仪监测荧光强度信号变化，并通过给目标细胞加上对应的电荷，对不同的酶进行分选收集.2010年，Yang等[29]提出了基于FACS的高通量筛选方法，成功定向改造了唾液酸转移酶.

2.3 表面展示

表面展示技术也是近年发展起来的一类高通量的筛选技术，主要包括噬菌体表面展示技术、细菌细胞表面展示技术、酵母表面展示技术、核糖体表面展示技术等.基本原理是利用DNA重组技术，将目标蛋白质富集在噬菌体、细胞、核糖体等表面，其应用主要体现在筛选蛋白与蛋白间的相互作用[30].在酶定向进化方面，Love等[31]用噬菌体展示的筛选方法对大肠杆菌糖基转移酶成功进行了改造；Yamada等[32]将3种纤维素酶(CBH，EG，BGL)展示在酿酒酵母细胞表面，在用包含PASC(phosphoric acid swollen cellulose)的微孔板对酵母株筛选时，与单一酶降解相比，展示在酿酒酵母细胞表面3种纤维素酶对PASC的降解提高了7倍.

3 结论与展望

定向进化技术已经成为改造酶性质的重要手段，近年来，酶的众多性质(如热稳定性、底物特异性、有机溶剂耐受性、立体选择性等)被成功改造，证实了定向进化技术的成熟与快速发展.一个定向进化实验主要包括构建高质量的突变文库和选择高通量的筛选方法，这两方面的发展是限制酶改造及新酶发现的瓶颈.易错PCR、DNA shuffling作为传统的基因突变方法仍得到广泛应用，而新的技术方法如ISM、RAISE等也为突变基因文库的构建增添了新的内容.在突变文库筛选方面，FACS发展最为迅速，它结合流式细胞仪快速、高通量的特点，大大改善了传统筛选人力依赖重、低通量的境况，为更多新酶的筛选带来了快捷.随着人们的努力，相信在不断的实验探索中，更多更好的定向进化技术还会不断涌现.

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AdvancesinEnzymeDirectedEvolutionTechnology

LI Zhenhua, ZHANG Zhiliang, FANG Xiujuan, LI Yanqiong, SHI Lue

(College of Life and Environmental Sciences, Hangzhou Normal University, Hangzhou 310036, China)

Directed evolution of enzyme is widely used to change the characteristics of enzyme, which mainly mimics the progress of natural evolution. Based on the neuter evolution technology represented as error-prone PCR, the development of sexual evolution technology makes directed evolution of enzyme is closer to natural evolution. At the same time, in order to deal with the contradictions between mutant libraries and limited screening methods, a series of high-throughput screening methods appears, so that the development of enzyme directed evolution is promoted. This essay mainly summarized some recent new methods and applications about mutant gene libraries and high-throughput screening methods.

enzyme directed evolution; mutant gene library; high-throughput screening method

2013-03-20

国家自然科学基金项目(31100583)；浙江省钱江人才计划项目(2012R10060).

石陆娥(1979—),女，副教授，博士，主要从事酶的固定化及修饰、生化分离等方面的研究.E-mail：shilue@126.com

10.3969/j.issn.1674-232X.2013.06.014

Q78

A

1674-232X(2013)06-0550-05