绿色荧光蛋白在蚕桑业的研究应用

李迎春,林健荣

(华南农业大学动物科学学院，广州 510642)

绿色荧光蛋白(green fluorescence protein；GFP)自发现以来备受世人瞩目。对于这样一种会自发发出荧光的蛋白分子，人们不光充满了好奇，更是充满了想要解开其发光机制的渴望。随着对GFP研究的不断深入，人们对其的认识也愈加深入，其在科学领域的应用价值和优势也愈加突显。科学家们不断地尝试和研究将这一神奇的蛋白应用在科学研究中，其对生命科学的研究发挥了不可替代的作用，催化生命科学研究的不断深入和发展。因此，本文将着重介绍GFP近几年在蚕桑业中的应用及研究进展，希望其能在蚕桑业中得到更加广泛和深入的应用，为蚕桑业的发展带来更多的经济价值。

1 绿色荧光蛋白(GFP)

1.1 GFP发现

GFP是由日本科学家下村修等人[1，2]在1962年从一种特殊水母(Aequorea victoria)中提取水母素时偶然发现的，它可以在紫外灯下自发地发出强烈的绿色荧光。美国科学家Shimomura[2]展示了GFP作为一种指示剂，跟踪和判断生物细胞的分子变化的功能。在此基础上，钱永健[3]创立了发多色荧光蛋白技术，即GFP肽链中一些特定的氨基酸被另一种氨基酸代替后，易于得到其他发其他颜色的突变体蛋白，这满足了体内标记和检测系统等不同研究的需要，为生物学的发展作出了很大的贡献。

1.2 GFP的性质

伴随着对GFP的不断认识和研究，科学家们逐渐明晰了其理化性质、发光原理，从而为进一步研究GFP的应用领域及价值打下坚实的理论基础。

1.2.1 GFP的理化性质[3，4]

GFP分子的形状呈圆柱形，分子质量为2.6KDa，由238个氨基酸构成，由3个外显子组成，分别编码69、98 和71 个氨基酸。其中，第65～67位氨基酸(Ser-Tyr-Gly)形成发光团，是主要的发光位置。而且，GFP 本身是一种酸性、可溶性天然荧光蛋白。它需要在氧化状态下才能发荧光，而且只有强的还原剂能使GFP变性转化成非荧光形式，从而使荧光消失。但是一旦重新暴露在空气和氧气中，GFP便立即恢复荧光。更重要的是，它们在很大的pH值范围内(pH值7～12. 2)的吸收、发射光谱也是相同的。

1.2.2 GFP的荧光原理

它之所以能够发光,是因在其包含238个氨基酸的序列中,第65至67个氨基酸(丝氨酸—酪氨酸—甘氨酸)残基，可自发地形成一种荧光发色团。GFP与荧光素不同，一种荧光素酶只能与一种对应的荧光素合作发光，而GFP不需要与任何物质结合，其发光团的形成不具物种特异性，只需用蓝光照射，不需要反应底物和辅助因子，就能自发发出稳定荧光，GFP 荧光至少能保持10min 以上，易于检测，灵敏度高。该蛋白激发光范围在395～475nm，发射光谱509～540nm之间[5-9]。因此，GFP作为一种广泛应用的活体报告蛋白，其作用是任何其它酶类报告蛋白无法比拟的。

2 GFP在蚕桑业中的应用

从GFP发现以来，其在生命科学中的应用领域及所体现的应用价值一直备受世人瞩目。因为GFP具有独特的发光原理和荧光性质，因此其逐渐取代其他发光物质，被广泛应用于生命科学中，发挥着不可取代的价值。在蚕桑业中亦是如此。为此，我们以GFP的指示作用这一优势用途，系统阐述其近年来在蚕桑业中的应用及发展。

2.1 GFP在蚕业研究中的应用

2.1.1 GFP在家蚕及茧中的表达

自从GFP被广泛地应用在科学研究中来，在蚕业研究发展中，很多科学家试图将GFP在蚕体中表达，试图将其应用在蚕业科学研究中。Wen等[10]在蚕丝蛋白启动子的控制下，在柞蚕原始卵母细胞中成功的表达出GFP。这说明GFP可以用于活细胞测定，通过显微镜直接观察GFP的荧光，灵敏度强易于检测，且在进一步说明其不具种属限制。

然而，GFP是否也可以在活体中表达呢？Guo等[11]获得重组Acserpegfp-EGT，注入5龄幼蚕的血腔内，5 d后只有在丝腺中观察到绿色荧光，并证实EGFP存在于彩色茧丝的水溶性部分中。王林美等[12]将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因与柞蚕核型多角体病毒转移表达载体pApM748BE重组子，在柞蚕蛹中高效稳定地表达了EGFP，并且EGFP在雌雄蛹间的表达水平无明显差异。这些研究说明当GFP的基因和我们感兴趣的有机体内所拟研究的蛋白质基因相融合时，蛋白质既能保持其原有的活性，GFP的发光能力也不受影响。这一系列研究表明GFP 对活细胞基本无毒害，对融合后的目的基因的结构功能没有影响，细胞转化后仍可连续传代。通过显微镜观察这种发光的“标签”，科学家就能做到对蛋白质的位置、运动、活性以及相互作用等一目了然。

因此，以GFP作为报告基因使实验者直接对蚕体进行观察筛选，为外源基因在家蚕中的表达研究提供了一种活体检测的手段。王宇等[13]将GFP基因重组到家蚕基因中，通过检测家蚕后代体内荧光强度的变化，比较了解显微注射法、精子介导法、脂质体法和压力渗透法等几种方法的优缺点。杨李阳[14]获得携带GFP基因的基因打靶载体，通过绿色荧光在G0代家蚕中筛选转基因蚕。这种检测手段极大地节省了人力、物力、财力，提高了生产力。那么，作为一种指示蛋白，GFP是否可以用来监视复杂多变的蛋白质的化学进程，帮助研究蛋白质的变化机制呢？这揭开了GFP在蛋白定位研究中的广泛应用。

2.1.2 GFP指示作用的应用

综上可以知道：GFP具有不依赖种属的性质；其分子量小，且是单体蛋白，易于构建融合表达蛋白，且易于转化；其可以自发发出稳定荧光，不需要任何其他辅助因子，且保持时间长，易于检测和观察；GFP 对活细胞基本无毒害，对融合后的目的基因的结构功能没有影响，细胞转化后仍可连续传代。正因为GFP有如此得天独厚的特点，科学家们不断尝试将其指示更加广泛地应用于生命科学中。

2.1.2.1 GFP定位作用

在生命科学研究中，如何将指定基因和蛋白定位在某个组织中，或者通过GFP定位目标基因及目标蛋白，从而可以进行进一步的研究成为了科学家们研究的热点。GFP的发现及发展应用为这一难题的解决发挥了不可替代的作用。张新民[15]通过GFP荧光定位柞蚕芳香蛋白基因启动子的区域，并通过荧光强度确定其核心区域。孟巧红[16]构建GFP标记的霍乱毒素B亚基与人胰岛素融合蛋白，利用GFP标签追踪到此融合蛋白可与小肠粘膜发生特异性结合。由此可见，GFP是以指示的作用在指定组织中成功定位，以其荧光作为指示为蛋白质组学研究带来极大的便利。试想，如果将GFP作为一种基因标志，那么它将会有怎样的优势？

2.1.2.2 GFP的基因标志作用

高志宏等[17]利用GFP为报告基因，研究不同截短的丝素重链基因启动子在家蚕组织中的表达为没有严格的组织特异性。Kato等[18]以GFP作为基因标志从家蚕血淋巴中纯化杆状病毒粒子，并研究其作为纳米粒子检测人体肾素受体的结合状况。这将GFP的指示作用发挥到了极致，为生命科学的研究带来了极大的便利，从而为转基因技术的应用带来了契机。

2.1.2.3 GFP在转基因技术中的应用

当然，家蚕作为一种经济动物，通过转基因对其进行基因改造，从而获得更多的经济价值成为科学家们的一个重要任务。GFP作为报告基因在转基因蚕的研究中发挥着举足轻重的作用。Uchino 等[19]以GFP作为报告基因，将携带转座子Minos的载体注入到蚕卵中培养转基因家蚕，首次证实在使用试管培养的mRNA时，Minos转座子对于构建载体培养转基因家蚕十分有效。赵越等[20]利用GFP作为报告基因成功筛选转入人胰岛素样生长因子(hIGF-1)基因的转基因家蚕。同年，李春峰等[21]利用GFP作为报告基因，成功获得了在后部丝腺特异表达植酸酶融合蛋白的转基因蚕。这为家蚕作为生物反应器的发展和应用奠定了坚实的理论基础和技术支持，具有极其重要的意义。

2.1.2.4 GFP在蚕体生物反应器中的应用

随着生命科学的不断深入研究，通过生物反应器表达一些我们想要获得蛋白等外源蛋白显得愈加重要。而家蚕作为一种很好的生物反应器，也深受各领域研究的重视。然而，如何高效表达外源重组蛋白是重要的难题。为此，构建高效的外源表达系统是一重要突破。Tatematsu等[22]为了构建一个系统以获得大量重组蛋白，通过检测GFP在家蚕丝腺中的表达量从而获得了强效的启动子，这对外源蛋白和生化药物的生产有重要意义。同年，Zhao等[23]以EGFP作为外源基因使用新型高效表达系统表达系统选择性在转基因家蚕丝腺内表达外源蛋白，从而证实其所构建的表达系统是目前为止最为高效的外源基因表达系统。Ishiyama等[24]以GFP作为指示基因证实在感染杆状病毒早期使用携带有 vp39启动子和HR3的 BEVS 表达载体系统可有效的表达可控质量的外源蛋白。进一步开发家蚕生物反应器，利用转基因蚕生产各种重组蛋白具有积极的促进作用。

家蚕作为生物反应器，幼虫虫体是重要的“反应箱”。Zhang等[25]以GFP作为报告基因在BmN细胞和家蚕幼虫中表达重组蜘蛛牵引丝蛋白，并发现溶解度是制约高产表达的主要因素。Nakajima等[26]以GFP作为报告基因，使用分子伴侣辅助重组家蚕核型多角体病毒杆粒在家蚕幼虫体内生产人α-1,4-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶。

然而，丝腺作为蚕体重要器官对于合成外源重组蛋白发挥了极其重要的作用。Xue等[27]以GFP为报告基因在家蚕丝腺中成功地表达了巨噬细胞刺激因子，并在第三代中仍能高效表达，这说明外源基因可稳定地整合到家蚕基因组中并能成功表达。同年，Li等[28]以GFP为报告基因，用BmN细胞表达人类胰岛素样生长因子(hIGF-I)。由此可见，GFP对发挥蚕体生物反应器的功能具有极其重要的意义，对于联通生命科学、生物医药学、材料学等不同领域学科的交叉发展和相互促进发展具有不可替代的作用。

2.1.3 增强型绿色荧光蛋白(EGFP)与多色荧光蛋白的应用

随着对GFP应用的不断深入，科学家发展了增强型绿色荧光蛋白(EGFP)，可以发出更强的绿色荧光，具有更强的知识作用。徐洁杰等[29]成功构建了增强型绿色荧光蛋白基因真核表达载体。杨惠娟等[30]以EGFP基因为标记基因将构建好的A3启动子缺陷piggy Bac转座质粒转入家蚕中，筛选家蚕组织特异性启动子。赵清霞等[31]成功构建了昆虫杆状病毒EGFP载体，并将共转染sf9细胞，成功表达。EGFP的使用更丰富了荧光蛋白的应用体系。

与此同时，多色荧光体系也得到了更广泛的应用。Liu等[32]以橘黄色荧光蛋白(OFP)作为外源基因在蚕这样的生物反应器中获得了高效表达，从而进一步获得从蚕血淋巴提取的携带OFP的重组病毒并可以如储存种子一样储存，用于大规模的表达。此过程省去了昂贵的细胞培养过程。因为OFP具有较高的荧光量子产率，成熟速度快，稳定，这意味着这种蛋白质应该是最良好的生物技术工具用于研究可视化，监视目标基因的在细胞正常生长期的变化。因此，这将使人们逐渐认识OFP的催化发光机制，及其在蚕业中的应用。

然而，为了增加实验的精准性，科学家们不再局限于单一荧光蛋白的应用，发展了应用双色荧光蛋白作为报告基因。王文兵等[33]利用GFP和RFP双色荧光蛋白分子作为报告基因分析重组家蚕杆状病毒感染家蚕细胞和幼虫，说明昆虫细胞大多数只感受1次同一来源的病毒。郭学双等[34]利用含有GFP和RFP双式荧光基因的转基因载体为鉴定团头舫β-actin启动子在家蚕BmN细胞和家蚕体内具有活性。这些研究更突显了荧光蛋白作为基因标志的精确性，并预示了其在生命科学中更广泛的应用前景。

2.2 GFP在桑树研究中的应用

GFP不仅在蚕业中有着广泛的应用，近年来其在桑树的研究中也发挥着重要的作用。王国芬[35]为研究肠杆菌在桑树体内的病原机制，将GFP和LuxAB 发光双标记基因整合到R18-2中，筛选到了发强绿色荧光的标记菌株R18-gfp-1，并研究了GFP标记菌在桑树中增殖情况和感染桑树的能力。刘嘉琦[36]以GFP作为报告基因，将重组桑低温诱导蛋白基因Wap25基因导入洋葱细胞表皮，发现绿色荧光在细胞质中表达。同年，陆小平等[37]分析了桑树低温诱导基因Wap25的序列，利用GFP作为报告基因构建了Wap25与GFP的重组质粒，并在洋葱表皮细胞中作了亚细胞定位。

综上所述，GFP还具有酶和生物素不具有的优势：虽然GFP不是酶，荧光信号没有酶学放大效果，因此GFP灵敏度可能低于某些酶类报告蛋白，但是，由于GFP荧光是生物细胞的自主功能，荧光的产生不需要任何外源反应底物，因此GFP作为一种广泛应用的活体报告蛋白，其作用是任何其它酶类报告蛋白无法比拟的；由于其他生物本身不含有GFP，因此不会出现假阳性结果，与荧光染料相比，它能避免染料扩散造成的定位不准，使结果真实可靠。这使得GFP等荧光蛋白作为报告基因具有得天独厚优势，必将更加广泛地、深入地应用到生物科学中。

3 问题与展望

近几年来，随着人们对GFP的认识的不断加深，其在生命科学领域得到了广泛的应用，发挥了不可替代的作用。在蚕桑业中，GFP的应用主要集中在蚕业领域的研究中，在桑树研究中的应用相对较少。在蚕桑业领域中，GFP的应用主要集中其指示作用在细胞、组织等活体表达、组织定位、基因标志、转基因技术、生物反应器等方面的应用。当然，这些方面的研究还需要进一步深入。近年来，对于GFP的应用主要集中在指示作用方面的基础研究，对于其应用到生产中还有很多的工作要做，尤其是其在家蚕作为生物反应器这一块的研究和应用。家蚕作为生物反应器的研究，融合了分子生物学、转基因技术以及蛋白的融合表达，而且贯通了生物医药、材料学等多学科领域。试想，如果通过GFP能够将其这些技术和各学科发展连贯并整合成为一个生产体系或者产业链，对于蚕业科学乃至生命科学将会有怎样的意义？这将有待于进一步地研究和探索。

GFP虽有诸多得天独厚的优势，但是其还是存在一些不足，即GFP不是酶，荧光信号没有酶学放大效果，因此GFP灵敏度可能低于某些酶类报告蛋白。那么，是否可以发展可以和酶类相媲美的高灵敏度的荧光蛋白呢？抑或发展出具有GFP和酶类双重优势的荧光蛋白从而取代GFP呢？这为生物科学的发展带来了更多的契机和可能。

面对科学的不断发展和进步，有问题同样会有期待。虽然GFP已广泛地应用于生命科学中，但是以多色荧光蛋白体系为基础的双色荧光蛋白乃至多色荧光蛋白的结合应用仍在发展中。这一技术对于基因工程和细胞工程技术的要求更加严格，对于科学研究成果的可靠性提高将发挥不可估量的价值。在生命科学发展的进程中，双色荧光蛋白技术的继续发展和应用一定会给我们带来更多的应用价值，将会为揭开生命科学之谜做出更大的贡献。

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