Duffy血型系统的分子遗传学及临床应用研究

雷旻

红细胞Duffy血型是人类血型系统中重要的血型系统之一，且与临床多种疾病相关，它在人群中的分布因种族不同而有较大的变化，Duffy血型系统的抗体可造成迟缓性、致命性的溶血性输血反应及新生儿溶血病［1-3］。笔者通过建立Duffy血型PCR-SSP基因分型方法，结合血型血清学方法，研究深圳地区人群Duffy血型基因的分子遗传学结构和多态性，为Duffy血型于HDN产前检查的可行性研究提供理论依据，报告如下。

1 材料及方法

1.1 样品 采用我院收集的孕妇及其丈夫的血液样品共104例新鲜血样，羊水1例(细胞DNA采用常规酚/氯仿法提取)。采取血清学方法检测Duffy血型的表现型。提取基因组DNA选用 PEL-FREEZ DNA 提取试剂盒(Lo：t038，Batch：27268)，A260/280均在 1.6 ～1.8。稀释到 65 ng/μl，于 -40℃ 冻存备用。

1.2 主要仪器与试剂 主要包括低温冰箱，控温高速离心机，紫外光测定仪，电泳仪，PCR扩增仪，凝胶成像仪等设备。Duffy血型分型试剂(Lo：t#RB01)由美国Singma公司提供，內有Fya和Fyb混合引物，TD buffer，內对照。Taq酶由Promega公司提供(Lo：t 20198221)。

1.3 方法

1.3.1 采用经典的血型血清学技术，包括盐水介质法、酶法、抗球蛋白介质试验等方法鉴定Duffy血型。

1.3.2 血型分子生物学方法：①在采集的EDTA抗凝血液中抽取基因组DNA。②以Genbank数据库查找相关血型标准基因序列，找出单核苷酸多态性位点(SNP)，灵活运用Primer 3.0软件，合成的引物序列为：A：5-CACTGCATCTGACTCCTGCAGA-3，以PCR-SSP(序列特异性引物)法直接鉴定血型基因的多态性。

1.4 基因频率计算 依据MourantAE方法。

2 结果

2.1 血液样品的Duffy基因型 Fya基因个体和Fy-a分型混合液反应，能够产生711 bp扩增片段。Fyb基因个体和Fy-b分型混合液反应，能够产生711bp扩增片段。Fyab基因个体，分别和两种分型混合液反应能够产生711 bp扩增片段。Fy(a-b-)个体，分别和两种分型混合液反应，不会产生特异性的PCR扩增片段，只产生429 bp内对照产物。见表1。

2.2 羊水Duffy血型的基因定型 用PCR-SSP 方法检测孕妇的羊水样品1例，检测出孕妇为Fy(a-b+)型，丈夫为Fy(a+b-)型。

3 讨论

Duffy血型系统作为人类红细胞血型系统最早发现的系统之一，是由Cutbush等在1950年经过多次输血而引起溶血的患者血清中发现一种抗体，称将其称为抗-Fya，因为患者姓Duffy，故称Duffy血型［4］。近年来随诊医学技术的不断进步，Duffy血型系统的研究取得较大的进展。Duffy血型抗原在自身免疫性疾病、新生儿溶血病、炎症、移植排斥反应、肿瘤等方面均有着重要的作用，其在临床疾病发生发展过程中作用以及意义正逐渐被人们所知，但具体变化机制仍不十分清楚，尚有很多问题仍需进一步探讨。这些问题的深入研究，将会在疾病的防治方面获得创新性的成果以及实效［5］。Duffy血型基因位于人类染色体的1q21～q25。一些Duffy血型的抗体可能是由于怀孕的刺激而产生的，但大多数是由于输血而引起［6］。Fya抗体的产生常常伴随产生其他的抗体。由于Fya的免疫原性中等，因此抗-Fya可以引起轻微的即发型或迟发型溶血性反应，但一些急性反应仍可能是致命的［7］。Fya和Fyb抗原胎儿出生时已发育完全，并在怀孕初期6～7周即可检测到该抗原。Duffy抗原是由不同亚单位组成的糖蛋白，Duffy糖蛋白在非红系的组织上照样存在。用血清学方法可以将Duffy血型分为4种常见表现型：Fy(a+b-)、Fy(a+b+)、Fy(a-b+)和 Fy(a-b-)。本研究内容通过了解中国人群中Fya、Fyb和Fy等位基因中核酸的变化，设计出基于PCR的技术，有助于诊断Duffy的基因型并预判其表型，建立DNA序列分析方法。本研究结果表明，用上述PCR-SSP法，所有血液样品均可正确判型。

综上所述，应用PCR-SSP方法能够准确检测血液和羊水样品的Duffy基因型，能够用于Duffy血型不合引起的新生儿溶血反应的产前诊断。

1 许剑锋，刘衍春，吴敏慧.PCR-SSP法检测Rh阴性无偿献血者Duffy血型的基因分型研究.现代诊断与治疗，2007，18：336-337.

2 张雄民，王晨，刘曦，等.上海地区稀有血型Duffy系统Fy～a阴性献血者筛查和临床应用.中国输血杂志，2010，23：293-294.

3 Parasol N，Cohen N，Zemishilany Z，et al.Duffyan tigen/R eceptor for chemokines(DARC)：Genotypesin Ashkenazi and Non-Ashkenazi Jews in Isreal.HumBiol，2001，73：307-313.

4 李剑平，刘显智，岩本贞彦，等.Duffy血型基因定型及其用于HDN产前诊断的探讨.中国输血杂志，2003，16：1-3.

5 张献清，马建岗，吴道澄.Duffy血型系统的分子遗传学及其临床应用.现代检验医学杂志，2006，21：30-32.

6 查占山，钱宝华.Duffy血型抗原的生物学功能及临床研究进展.临床输血与检验，2006，8：67-70.

7 Christina LA，John AB，M arie DB，et al.O verexpression of the duffy antigen/receptor for chemokine(DARC)by NSCLL tumor cells resu lts in increased tumor necrosis.Bmc Cancer，2004，23：28.