昆虫病原线虫和共生细菌定殖关系的研究进展

王立婷，丘雪红，吴春艳，4，陈镜华，韩日畴*

(1.中国科学院华南植物园，广州 510650;2.广东省昆虫研究所，广州 510260;3.中国科学院研究生院，北京 100039;4.中山大学生命科学学院，广州 510275)

近年来，环境及食品安全问题日益突出，人们对使用生物农药取代传统化学农药防治农林虫害的诉求也日渐强烈。斯氏属Steinernema 与异小杆属Heterorhabditis 昆虫病原线虫(entomopathogenic nematodes，EPNs)是高效而安全的生物杀虫剂，分别与致病杆菌属Xenorhabdus和发光杆菌属Photorhabdus 共生细菌互惠共生，在害虫的安全防治中发挥了重要作用，受到了科学界和商业界的高度重视(Georgis et al.，2006;Kaya et al.，2006)。

感染期幼虫(infective juveniles，IJs)是昆虫病原线虫一生中唯一具有侵染能力和可自由生活于寄主体外的虫态，其肠道携带特异的共生细菌。在自然界，感染期线虫存在于土壤中，主动搜索适合的昆虫寄主，利用虫体的自然开口(如肛门、气门)或节间膜进入昆虫血腔，并释放肠腔中携带的共生细菌(Strauch and Ehlers，1998;Ciche and Ensign，2003)杀死昆虫。共生细菌还产生胞外酶、抗菌素等物质，分解昆虫尸体，为线虫的生长和繁殖提供理想的环境(Akhurst，1980，1983;Goodrich-Blair and Clarke，2007;Clarke，2008)。昆虫体内线虫密度高和营养匮乏时便形成可携菌的感染期幼虫(Wang and Bedding，1996;Cagnolo et al.，2004)。

昆虫病原线虫与共生细菌的共生关系表现为共生细菌为线虫生长发育提供营养，同时作为关键的杀虫因子，线虫作为载体将共生细菌携带进入昆虫体内(Goodrich-Blair and Clarke，2007)。共生细菌于感染期线虫肠道中的定殖是昆虫病原线虫与共生细菌互惠共生关系中的关键时期(Goodrich-Blair and Clarke，2007)。定殖关系具有严格的种属特异性，从自然界分离的每种异小杆或斯氏线虫都被特定的细菌定殖(Akhurst，1983;Han et al.，1990)。将线虫培养于非特异共生的细菌可获得肠道不带菌的感染期线虫(Han and Ehlers，1998;Ciche and Ensign，2003)。在昆虫病原线虫商业化生产过程中，线虫与共生细菌组成单菌培养体系(Bedding，1981;Wouts，1981;Lunau et al.，1993)。因此，研究共生细菌与昆虫病原线虫之间的定殖关系对这类生物杀虫剂的致病力和产业化生产都具有重要意义(Ffrench-Constant et al.，2003;Ehlers et al.，2004;Ciche et al.，2006)，也为共生细菌的分子机制研究提供了良好的生物模型(Goodrich-Blair and Clarke，2007)。本文从定殖过程、定殖位点、定殖相关基因和调控因子以及定殖研究方法概述昆虫病原线虫和共生细菌定殖关系的研究进展，为理解自然界中广泛存在的微生物共生分子机制提供参考。

1 定殖的过程及定殖位点的结构

共生细菌对IJs 的定殖过程具有阶段性，主要包括起始与增殖阶段。致病杆菌与发光杆菌于线虫寄主体内的定殖位点有较大差异。对共生细菌定殖过程及定殖位点的研究有助于理解细菌定殖于线虫的机理。

1.1 致病杆菌在斯氏线虫肠道内的定殖

研究发现，共生细菌X.nematophila 约1个或几个菌体细胞便可开始对斯氏属线虫S.carpocapsae的定殖;这些细菌在斯氏属线虫肠道内繁殖并形成50-200 CFU/IJ 的稳定种群(Martens et al.，2003)。致病杆菌在斯氏属线虫中的定殖位点是肠道前端的一个特化结构:菌囊(Bird and Akhurst，1983;Martens et al.，2003;Martens and Goodrich-Blair，2005)。菌囊在致病杆菌定殖前便形成(Bird and Akhurst，1983)，但共生细菌的存在会影响菌囊的大小及形状，没有被定殖的菌囊比被定殖的菌囊更短更宽，随着感染期线虫保存时间的增加，单条线虫携菌量下降，菌囊也会变得更短(Flores-Lara et al.，2007)。X.nematophila 细菌在菌囊内附着在统称为内囊结构(intravesicular structures，IVS)的球状体无核簇(Martens and Goodrich-Blair，2005)。球状体没有明显的内部结构，细胞间隙包含以麦胚凝集素应答的粘液类物质(Martens and Goodrich-Blair，2005)。IVS 以及粘液类物质在定殖中的功能仍未明了，可能起到营养及特异性附着的作用。在感染期线虫体内，菌囊的前端通过一个保持开放的管状结构与食道连通(Snyder et al.，2007)，X.nematophila 需要通过这个连接结构进入定殖位点。这一连接结构似乎起着一个限制性位点的作用，防止非特异性共生细菌进入菌囊(Snyder et al.，2007)。这个发现或许可以帮助理解为何将线虫培养于非特异共生的细菌，可获得肠道不携菌的感染期线虫。类似的特异性选择同样存在于费氏弧菌Vibrio fischeri 对夏威夷短尾鱿鱼Euprymna scolopes 的定殖过程中(Nyholm et al.，2000)。也许在S.carpocapsae 线虫体内，这种粘液状物质同样存在于菌囊与食道的连接处，通过识别与粘附X.nematophila 菌体表面的特异结构，将细菌细胞“送入”目的地(Goodrich-Blair，2007)。

显微观察显示，X.nematophila 只定殖于线虫菌囊内靠近肠道的远端部分，此区域的末端似乎是关闭的，阻断了菌囊与肠道的连通(Snyder et al.，2007)。当携带共生细菌的感染期线虫持续暴露于昆虫血淋巴中，菌囊后部的X.nematophila 向前端移动，达到与食道的管状连接处位置从而充满了整个菌囊，然后通过狭窄的后部末端通道，进入肠道并从肛门排出(Snyder et al.，2007)。共生细菌被限制于菌囊远端区域的可能原因有两个:一是线虫菌囊内充满了类似粘液的无定形基质(很可能与IVS 周围分布的粘液类物质相关)，X.nematophila 细胞“嵌入”这种基质中(Snyder et al.，2007)，它限制了细菌的可动性并促进菌囊分区(Goodrich-Blair，2007);二是线虫寄主在运动过程中自然发生的肌肉收缩反应也可促使菌囊被分隔为两个不连续的区域(Martens and Goodrich-Blair，2005;Goodrich-Blair，2007)。

一些学者报道了斯氏线虫属不同种的菌囊壁结构呈现差异。斯氏线虫S.glaseri 与另一种斯氏线虫的菌囊壁厚度不同但都具有微绒毛，而构成S.carpocapsae 与S.feltiae 菌囊壁的细胞却没有微绒毛结构(Bird and Akhurst，1983;Endo and Nickle，1995;Snyder et al.，2007)。线虫菌囊壁定殖位点结构上的多变性可能也参与了特异性选择细菌的过程(Snyder et al.，2007)。

1.2 发光杆菌在异小杆线虫肠道内的定殖

与致病杆菌不同，发光杆菌属细菌特异性附着于线虫寄主肠道的前端细胞，然后以不同程度延伸至肠道其它部分甚至布满整条肠道(Ciche and Ensign，2003)。最近研究表明，共生细菌的传递实际上是来源于母体(Ciche et al.，2008)。雌雄同体的成虫取食细菌，一些共生细菌细胞不被咽压碎而进入肠道，特异性附着于末端肠上皮细胞INT9，随后迁移并感染邻近的直肠腺细胞(rectal gland cells，RGCs)，以包涵着细菌的小液泡方式在RGCs 内繁殖。卵在成虫体内孵化后，子代幼虫以母体为食并发育，进行着噬母(endotokia matricida)过程。此时母体直肠腺细胞破裂，发光杆菌被释放至体腔中，可被幼虫摄取。新形成的IJs 被单个细菌定殖，菌体细胞特异性粘附在IJs咽部后方的前肠瓣膜细胞(pre-intestinal valve cell，PIVC)上，并繁殖至100 CFU 的种群密度。发光杆菌定殖线虫肠道可分三个阶段:母体直肠腺的定殖、IJs 肠道的定殖、IJs 定殖位点的繁殖(Ciche et al.，2008)。

定殖位点超微结构的电镜观察显示，共生细菌侵染母体直肠腺细胞RGCs时，包涵着细菌的小液泡不断扩张并分裂，一种颗粒状的连接物将它们串联在一起使其无法分散。侵染过程中小液泡膜总是清晰可见，直到母体的RGCs 破裂。感染期线虫不取食，定殖于其肠道的共生细菌达到一定种群密度后便会停止增殖，推测进入半休眠状态，不会被没有营养来源的IJs 消化。在一些异小杆线虫的感染期幼虫肠道内，定殖的发光杆菌似乎被一层非细胞结构的基质或者膜保护着，防止它们被寄主消化(Ciche，et al.，2008)。

2 与定殖相关的基因与调控因子

定殖过程中，共生细菌与线虫之间特异的分子和细胞界面活动是由遗传因子决定的。业已发现，定殖关系的相关基因涉及细胞表面特异性决定因子、菌毛结构、生物代谢以及细胞外膜脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)合成途径等，定殖关系的一些调控基因也已被鉴定并研究。了解参与定殖的基因及其调控机制对阐明共生关系分子机理具有重要意义。

2.1 致病杆菌的定殖基因与调控因子

研究表明，预测编码膜蛋白的三个基因nilA、nilB、nilC(nematode intestine localization)是X.nematophila 特异性定殖线虫寄主所必需的(Heungens et al.，2002;Cowles and Goodrich-Blair，2004)。这三个nil 基因位于同一大小约3.5 kb 的基因座，nilA 编码90个氨基酸的内膜蛋白，nilC 编码282个氨基酸的膜间质导向脂蛋白(Cowles and Goodrich-Blair，2004)，nilB 则编码466个氨基酸的普遍存在于粘膜性病原菌的外膜(桶型蛋白(Heungens et al.，2002)。NilB 的(桶结构模型具有14个穿膜氨基酸链，7个细胞表面环以及N 端球状结构域。插入及删除突变证实了6 号细胞表面环状结构及N 端球状结构域在起始定殖过程中起关键作用(Bhasin et al.，2012)。有趣的是，nilABC 基因为X.nematophila 所特有，赋予其专化性定殖S.carpocapsae 线虫的能力。尽管Nil 蛋白的作用机制仍未明了，但已有人提出这些蛋白可能是细菌细胞与IVS 相互作用的特异决定因子，通过特异性识别或粘附过程直接作用于线虫体内环境而促进定殖(Cowles and Goodrich-Blair，2004，2006，2008)。

类似于Nil 蛋白，菌毛结构可能也是与寄生环境直接发生作用的共生细菌细胞表面特异决定因子(Martens and Goodrich-Blair，2005;Chandra et al.，2008)。革兰氏阴性菌中，细胞表面菌毛介导了细菌细胞对生物(Stabb and Ruby，2003)及非生物(Otto et al.，2001)目标表面的粘附作用。一些病原微生物利用菌毛对靶细胞表面糖蛋白的特异性结合来侵染寄主组织细胞(Tullus et al.，1992;Connell et al.，1996)。X.nematophila 可合成一种耐甘露糖(mannose-resistant，Mrx)的分子伴侣引导型菌毛(He et al.，2004)，其编码基因一般为含有5个结构基因的mrx 操纵子，可被全局性调控因子Lrp 正向调控及CpxR 负向抑制(He et al.，2004;Tran et al.，2009)。最新的研究结果发现，在昆虫寄主活体培养条件下，Mrx 菌毛为X.nematophila 定殖线虫提供了一个具有竞争力的优势(Snyder et al.，2011)。

起始定殖后，共生细菌可在定殖位点增殖说明它们获得了营养。Martens 等(2005)发现一些X.nematophila 的代谢突变体可起始定殖但无法在定殖位点正常繁殖，这说明S.carpocapsae 定殖位点的营养环境对于共生细菌并不十分适合。serC、thrC、aroA、aroE、pabA、trpE、tyrA-pheA、leuB、tdk 等突变菌株均具有不同程度的定殖能力缺陷，这些基因涉及了甲硫氨酸、苏氨酸、对氨基苯甲酸及维生素B6等代谢过程(Martens et al.，2005;Orchard and Goodrich-Blair，2005)。其中甲硫氨酸、苏氨酸生物合成途径对共生细菌定殖能力的影响表现得尤为显著。这些结果显示共生细菌的增殖对甲硫氨酸及苏氨酸需求较高，但线虫定殖环境中的甲硫氨酸及苏氨酸含量有限。PixA是致病杆菌细胞中富含甲硫氨酸的一个胞内晶体蛋白，可在定殖时期表达。X.nematophila 的pixA 突变体在定殖线虫肠道的能力方面要比野生型具有优势，这说明在定殖过程中，PixA 的合成可能是个代谢负担，降低了共生细菌在线虫环境中的适应能力(Goetsch et al.，2006)。代谢途径中断可能会导致某种中间体物质在细菌细胞中的过量积累，从而影响X.nematophila 在菌囊中的增殖能力。另一方面，这些生物合成途径可能影响维持斯氏属线虫与致病杆菌属细菌共生关系信号物质的产生(Goodrich-Blair，2007)。此外，预测编码X.nematophila 细胞Fe-S 装配装置的iscRSUA-hscBA-fdx 基因座协同表达也被证明是定殖线虫寄主所必需的(Martens，2003)。

NilR、Lrp、CpxR、RpoS 被证明是Xenorhabdus 共生细菌与Steinernema 线虫间寄生关系所必需的调控因子。NilR为包含α 螺旋-转角-α 螺旋结构的DNA 结合蛋白，抑制着定殖必需基因nilA、nilB、nilC 的表达(Cowles and Goodrich-Blair，2006)。NilR 的异位表达导致X.nematophila 定殖水平降低，这可能是由于nilA、nilB、nilC 基因没有得到足够的脱阻抑作用(Cowles and Goodrich-Blair，2006)。

全局性调控因子Lrp、CpxR 正是通过与小转录因子NilR 的协同作用(Cowles and Goodrich-Blair，2004，2006)，调节nil 基因座的表达从而影响嗜线虫致病杆菌定殖能力(Herbert et al.，2007，2009)。lrp 基因编码亮氨酸应答的调控蛋白Lrp，调控着X.nematophila 中约65% 的蛋白表达，其中包括了对定殖因子nil 基因的抑制作用(Cowles et al.，2007)。值得注意的是，X.nematophila 的lrp基因突变反而导致定殖水平与线虫产量的降低，而nilR 突变体并没有相似的表型。这说明lrp 突变导致的定殖缺陷不是由于nil 基因脱阻抑导致的，Lrp 可能还调控着其他未知的定殖因子(Cowles et al.，2007)。同时，Lrp 还调控着许多代谢相关基因，所以lrp 突变体菌株无法在定殖位点正常增殖可能是因为不恰当的代谢指令所导致的(Cowles et al.，2007)。CpxRA 双元信号系统调控着X.nematophila 中膜定位及分泌型蛋白的基因表达，是致病杆菌病原性与共生性所必需的(Herbert et al.，2007)。cpxR 基因的突变影响了X.nematophila的定殖能力，这是由于受其正向调控的nil 基因没有得到足够的脱抑制作用而正常表达(Herbert et al.，2009)。总结起来，在X.nematophila 感染和生长早期不需要定殖因子时，nil 基因的表达受Lrp调节子的抑制，而在需要传递到新寄主时的繁殖后期又受CpxR 的诱导而表达(Richards and Goodrich-Blair，2009)。CpxRA和Lrp 调节子具有多 效 性(Herbert et al.，2007;Cowles et al.，2007)。CpxR 正向影响X.nematophila 细菌的运动性、分泌型脂肪酶活性及定殖相关基因的转录;反向影响溶血素、蛋白酶、抗菌素活性及菌毛蛋白编码基因mrxA 的表达(Herbert et al.，2007，2009)。Lrp 正向调节X.nematophila 中多种溶血素基因，反向调节线虫肠道定殖基因nilA、nilB、nilC 的表达(Cowles and Goodrich-Blair，2004，2005;Cowles et al.，2007)。同时，Lrp 调节子还能作为细胞内代谢状态的传感器(Cowles et al.，2007;Herbert and Goodrich-Blair，2007)，通过变动营养可用性来达到对适应性的协调。这种对外界环境变化的感应和响应在寄主-微生物之间关系中极为重要(丘雪红等，2010)。

定殖因子受到抑制表明它们在生活周期的其他阶段(如昆虫感染期)对共生细菌可能是不需要的(Goodrich-Blair and Clarke，2007;丘雪红等，2010)。为了互惠共生关系，线虫与共生细菌都需要付出一定的代价。不带菌S.carpocapsae IJs存活时间要比携菌的长，这表明不取食的感染期线虫需要消耗自身为肠道中共生细菌的生长提供营 养(Mitani et al.，2004;Emelianoff et al.，2007)。对于共生细菌来说，IJs 体内的定殖位点是个营养有限且具有压力的生存环境(Martens et al.，2005;Goodrich-Blair，2007)。X.nematophila稳定期(S因子RpoS 对于定殖是必需的，rpoS 突变体具有与野生型一致的体外生长能力及对昆虫的致病力，但无法定殖线虫寄主(Vivas and Goodrich-Blair，2001)。在许多革兰氏阴性菌中，(S作为转录因子，调控一系列抵御环境压力及寄主关系相关操纵子的转录(Vivas and Goodrich-Blair，2001)。也许在X.nematophila 定殖过程中，RpoS 诱导表达的操纵子可以帮助细菌适应线虫寄主的定殖环境(Goodrich-Blair，2007)。

2.2 发光杆菌的定殖基因与调控因子

全基因组测序结果分析表明，P.luminescens TT01 基因组中包含了大量与共生关系相关的基因(Duchaud et al.，2003)。一些与食物信号以及营养作用相关的基因业已被报道(Bintrim and Ensign，1998;Ciche et al.，2001;Joyce and Clarke，2003;Watson et al.，2005;Joyce et al.，2008)，但对于发光杆菌专化性定殖线虫的分子机制仍然缺乏了解(Gaudriault et al.，2006)。

pbgPE 操纵子是发光杆菌中第一个被发现与共生相关的基因。P.luminescens 的pbgPE 操纵子与哺乳动物病原沙门氏菌 Salmonella enterica 的pmrHFIJKLM 操纵子同源。pmrHFIJKLM 编码的蛋白参与细菌细胞膜脂多糖(LPS)的合成与修饰，从而提高细菌对寄主产生的抗菌肽(CAMPs)等物质的抵抗能力(Gunn et al.，1998，2000)。pbgPE 基因的突变使得共生细菌对抗菌肽物质更为敏感，同时也使得P.luminescens 无法定殖线虫(Bennett and Clarke，2005;Easom et al.，2010)，这说明pbgPE 操纵子是发光杆菌病原性和共生性所必需的(Bennett and Clarke，2005)。这种抵御寄主抗菌肽的能力促进了Salmonella typhimurium对Caenorhabditis elegans 线虫的持续感染(Alegado and Tan，2008)。这一发现提示我们，pbgPE 突变体的定殖缺陷可能是由于该突变体不能抵抗线虫母体肠细胞所产生的抗菌物质。也许发光杆菌也必须克服线虫的体液免疫反应才能完成定殖过程。

Easom 等(2010)发现，除pbgPE 操纵子外，galU 与galE 基因也参与了LPS 生物合成，同时也影响共生细菌 P.luminescens TT01 对 H.bacteriophora 线虫的定殖能力。galU 与galE 的突变导致P.luminescens 失去对昆虫的致病力，同时也无法起始定殖线虫，这可能是它们的LPS 生物合成途径受到影响的缘故。pbgPE、galE 及galU基因的鉴定充分暗示了细胞外膜LPS 在发光杆菌定殖线虫中的重要作用;asmA 与proQ 基因被发现也参与了发光杆菌的定殖过程(Easom et al.，2010)。

非特异共生的发光杆菌无法附着 H.bacteriophora 成虫的INT9 细胞，从而无法通过感染母体直肠腺细胞而传播至下一代感染期线虫。与Xenorhabdus—Steinernema 类似，发光杆菌的专化性定殖关系似乎也存在着特异的细胞表面结构识别作用。P.luminescens TT01 基因组中含11个预测编码菌毛的基因座，其中有两个已被鉴定并报道(Meslet-Cladiere et al.，2004;Somvanshi et al.，2010)。mad(maternal-adhesion-defective)操纵子含有8个结构基因，预测编码一种细胞表面的分子伴侣引导型菌毛。madA 突变体无法附着线虫母体肠细胞，从而无法正常传播至异小杆感染期线虫(Somvanshi et al.，2010);另一个编码菌毛结构的操纵子mrf 含有9个结构基因，但它在定殖过程中是否起到作用还未被鉴定(Meslet-Cladiere et al.，2004)。

开始定殖后，由于不取食的感染期线虫体内能量储备有限(Selvan et al.，1993)，定殖在线虫肠道内的共生细菌必须及时做出调整，降低对寄主的营养依赖性以适应环境。此时，共生细菌除了启动饥饿机制外，还诱导细胞酸化以降低生长速度，细胞内物质代谢也从三羧酸循环(TCA)转变为磷酸戊糖代谢途径(PPP)以克服氧化应激及营养匮乏，同时还降低了细胞能动性并形成生物被膜以增加定殖的持久性(An and Grewal，2010)。这些细胞活动的变化是发光杆菌在线虫肠道内进行着大量基因转录水平的重调所产生的适应性结果。An 等(2010)发现，体外培养与定殖于IJs 肠道的P.temperate 细菌表达水平不同的包括细胞表面结构、调控、压力应答、核酸修饰、转运蛋白、代谢途径以及一些未知的转录单元7类基因。其中嘌呤代谢相关基因purL 的突变使得与其体外共培养的线虫无法形成子代感染期幼虫(An and Grewal，2011)，这是由于细菌形成生物被膜的能力下降所导致的。鉴于嘌呤代谢在脂多糖(LPS)生物合成中的重要作用，purL 基因突变可能通过影响LPS 的修饰从而无法正确形成生物被膜结构。事实上，LPS 的遗传修饰影响共生关系中微生物在寄主体内的寄生，这种现象已在许多互惠共生关系如费氏弧菌Vibrio fischeri 与夏威夷短尾鱿 鱼Euprymna scolopes(DeLoney et al.，2002;Adin et al.，2008)、气单胞菌Aeromonas spp 与水蛭leeches(Braschler et al.，2003)、中华根瘤菌Sinorhizobium fredii 与豆科植物legumes(Buendia-Claveria et al.，2003)中发现。

已发现的参与发光杆菌定殖异小杆线虫的调控因子有HexA 与HdfR(Joyce and Clarke，2003;Easom and Clarke，2011)。转录调控蛋白HexA是共生关系的抑制蛋白，与野生型菌相比，hexA 突变体能支持更多线虫的生长发育(Joyce and Clarke，2003)。微点阵分析显示HexA 抑制了发光杆菌中包括晶体蛋白的产生等几个活性(Joyce and Clarke，2003)，但被其直接调控的定殖因子还未被鉴定。同时hexA 突变体显著减弱了对昆虫的毒力，这表明HexA 参与调控了发光杆菌病原性与共生性之间的转换(Joyce and Clarke，2003;Joyce et al.，2006)。hdfR 基因编码一种LysR 型调节子，调控了P.luminescens TT01 中约124个基因的表达，这些基因涉及了精氨酸的代谢、羟基苯乙酸酯的分解以及色素的产生(Easom and Clarke，2011)。相较于野生型菌株，hdfR 突变菌株在感染线虫母体直肠腺细胞及后代发育的“噬母”过程中均出现了明显的滞后效应，并影响感染期幼虫定殖率。微点阵数据显示，hdfR 的突变导致TT01共生细菌细胞内代谢出现微调，但这种变化不影响突变株在线虫母体内的繁殖能力。是何种机制驱使发光杆菌侵染线虫母体直肠腺细胞仍不清楚，hdfR 突变株具有正常的母体内繁殖能力却有着极低的液泡形成率，预示着细菌可能产生某种未被鉴定的信号物质促使小液泡的形成(Easom and Clarke，2011)。最后，HdfR 还调控了两个参与细胞外膜脂多糖(LPS)O 抗原形成的基因wblABCD、wblLGHIJ(Easom and Clarke，2011)，所以hdfR 突变也可能通过影响P.luminescens LPS 的形成从而影响定殖。

3 研究定殖作用的方法

目前研究共生细菌定殖线虫的方法主要有IJs头部切割法、荧光标记共生细菌法以及IJs 组织破碎法。这些方法相辅相成，极大地加速了定殖关系分子水平研究的进程。

3.1 IJs 头部切割法

为了判断感染期线虫肠道是否携带共生细菌，可利用手术刀片将单个感染期线虫的头部切开，喷出线虫的前肠，以0.1%的龙胆紫染色后置于显微镜下观察，可见着色的杆状共生细菌(Han et al.，1990;Han and Ehlers，1999;Han and Ehlers，2000;Vivas et al.，2001)。这种头部切割观察共生细菌定殖情况的方法快速直观，不需要对共生细菌进行遗传改造。缺点是无法进行活体观察，且操作技术要求较高。

3.2 荧光标记共生细菌法

Ciehe 等(2003)利用转座的方法，将含有绿色荧光蛋白编码基因gfp 的转座子整合至共生细菌的基因组中，构建出具有绿色荧光表型的共生细菌。将这种带有GFP 标记的共生细菌与无菌的卵或感染期幼虫共培养，当第二代感染期线虫形成后便可通过荧光显微镜观察线虫肠道的定殖情况。这种方法实现了定殖的活体持续性观察，使得定殖位点以及整个定殖过程清晰可见。然而，线虫对含有GFP 标记和不含GFP 标记的共生细菌偏好不同。线虫一般偏好不含GFP 标记的共生细菌，如果将线虫置于两者的混合环境中，线虫肠道内只含有不带GFP 标记的共生细菌(Ciche and Ensign，2003)。尽管如此，GFP 在多篇报道中已被证明不会影响共生细菌的生理生化特性、对昆虫寄主的病原性以及与线虫寄主的共生性。它为今后研究共生细菌在感染期线虫肠道中的定殖及释放提供了有价值的工具。

3.3 IJs 组织破碎法

以上的两种方法属于对共生细菌定殖线虫的定性检测手段，无法对每条感染期线虫的携菌数量进行准确的分析。Cowles 等(2002)利用组织破碎的方法对单个感染期线虫的携菌数量进行了定量测定。取单条IJ 或者确定数目的IJs 进行体表消毒，再用一种恒温水浴声波仪对线虫进行组织破碎以释放定殖的共生细菌，收集组织悬浊液混匀后稀释至一定倍数接种至LB 平板上培养，计数平板上的菌落数以确定每条感染期线虫定殖的CFU。随着感染期线虫储存时间的变化，其肠道中定殖的共生细菌数量也发生变化(Emelianoff et al.，2007)。这种定量的方法可为线虫和共生细菌复合体致死昆虫寄主能力测定提供参考。

4 结语与展望

昆虫病原线虫是应用前景广阔的新型生防因子。这类线虫与共生细菌的共生关系对这类生物杀虫剂的致病力和产业化生产都极为重要(丘雪红等，2010)。定殖阶段是昆虫病原线虫-共生细菌共生关系中的一个关键时期，对定殖分子机制的研究将极大地促进对两者共生性的理解。多个共生细菌全基因组的测序已使定殖关系的研究有了令人瞩目的进展，但其具体的作用机制及完整的调控网络还未揭去“神秘面纱”。共生细菌细胞感应线虫环境的何种因素从而启动定殖因子的表达?还有哪些因子参与了特异性定殖作用?随着后基因组学分析如功能基因组学、转录组学、蛋白质组学的应用，介导共生细菌与昆虫病原线虫特异性定殖关系的分子机制与调控网络也将日渐明朗。

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