植物精油蒸气与空气负离子在食品保藏中的应用研究进展*

杨乔木，谢春，闫博文，陈硕，王一非

(上海应用技术学院香料香精技术与工程学院，上海，201418)

近年来中国的食品安全问题广受关注。随着人们对健康生活的日益追求，迫切需要安全和高效的天然抗菌剂来代替化学合成抗菌剂。天然抗菌剂需要具备抑制微生物初始数量和生长速率的双重功能，既能作为食品添加剂直接加入到食品中，也能作为抗菌剂对食品的表面以及周围的暴露环境进行杀菌。

植物精油是一类由植物产生的次生代谢物质，具有强烈气味。有关精油抑菌性的研究始于近10年，这些研究囊括了数种精油对于食品腐败菌的抑制作用，并且探究了其中抑菌效果较好的几种精油的抑菌原理。精油在水溶液中具有良好的抑菌效果，但作为食品添加剂加入到食品中可能会影响食品本身的感官效果。解决这一问题的有效方法是利用精油蒸气，既可以达到防腐保鲜的效果，又可以减少对食品感官的影响。

空气离子发生器是一种使用高压促使空气分子电离，产生空气离子的设备。空气离子是空气分子在光照、辐射、流动气体和水的作用下分解产生的。大多数商业离子发生器产生空气负离子(negative air ions，NAI)。近年来，空气负离子作为抗菌剂应用于食品中，成为新的研究热点。

1 精油蒸气在离体条件下的抑菌活性研究进展

1.1 精油蒸气在离体条件下抑菌活性的测定方法

精油蒸气在离体条件下的抑菌活性的研究尚未系统化，Lopez等(2005)采用圆盘挥发法，将浸渍了精油的圆纸片放在培养皿盖中，然后将接种了试验菌的培养皿底板立刻倒扣在盖子上，并用保鲜膜密封［1］。该方法的缺点是精油或精油蒸气可能与培养皿材料相互反应，或者密封不足导致蒸气流失。Becerril等(2007)对此法做了改进，在修改了的方法中，将5mL的琼脂培养基加入到培养皿盖中，对整个培养皿进行密封，从而防止精油蒸气吸附在塑料的培养皿盖上［2］。Tyagi等(2011)使用“致死时间实验(kill time assays)”，将细菌暴露于某浓度的精油蒸气中一段时间，随后移除浸渍过精油的纸片，继续培养并观察微生物的生长，从而确定精油蒸气的动态抑菌活性［3］。Caccioni等(1997)提出了一种不同的方法来研究活性分子在顶空、培养基表面和内部之间的分配，他们设计了一种特殊的瓶盖，瓶盖内部带有小钢钩，小钢钩末端固定一个直径6 mm的滤纸片，在容积为10mL的瓶子中装入5mL接种了微生物的固体培养基，然后将瓶盖盖在瓶子上并密封。随着时间的变化，通过顶空自动气相色谱仪，对挥发性物质(顶部空间和培养基之间)的分配动态和微生物代谢物的产生等进行分析［4-5］。

1.2 精油蒸气的抑菌活性研究

研究者通过1.1的离体方法，发现多种精油蒸气对多种细菌、霉菌和酵母具有抑菌活性。Nerin团队(2007，2005，2009)发现丁香、肉桂、百里香、牛至精油蒸气对于细菌、真菌和酵母菌均有良好的抑制效果，而生姜，迷迭香等精油蒸气的抑菌性略差［6-8］。Lopez等(2007)采用单滴微萃取，气相色谱-质谱联用(SDME，GC-MS)检测精油蒸气的成分随时间的变化，并通过主要成分分析法确定香荆芥酚、百里香酚、肉桂醛为最有效的成分［9］。此外，Nedorostova等(2009)通过改进的圆盘挥发法研究了27种精油蒸气对5种食源性细菌的离体抑菌效果，发现含硫精油和百里香精油效果最好［10］。Goni等(2009)研究了肉桂和丁香精油蒸气结合使用时对于4种革兰氏阴性菌和4种革兰氏阳性菌的抑制作用，并对2种成分之间的相加效应、协同效应和拮抗效应加以确定，结果发现在一定浓度范围内(肉桂18～136 mg/L，丁香9～90 mg/L)，肉桂和丁香精油蒸气的组合没有协同效应［8］。刘晓丽等(2010)比较了丁香精油、肉桂精油及混合精油蒸气对供试细菌、霉菌和酵母菌的抑制作用，发现它们对霉菌的抑菌作用明显高于酵母菌和细菌，同时发现混合精油中的2种成分对细菌的抑制有拮抗作用，对酵母菌的抑制没有影响，对Aspergillus flavu和A.nier有相加作用，对Penicillium citrinu有协同作用［11］。

1.3 精油蒸气的抑菌机理研究

由于精油蒸气的成分复杂，关于精油蒸气的抑菌机理尚处于起步阶段，其主要作用机制是对微生物细胞的多种破坏作用，主要起抑菌作用的成分为一些醛类和单萜烯类。Tyagi等(2010，2011)利用扫描电子显微镜，透射电子显微镜和原子力显微镜发现微生物被精油蒸气处理过后，细胞膜破裂和细胞质外泄现象更加明显，细胞高度降低，细胞表面粗糙度显著增加。他们还利用气相色谱-质谱联用 (GC-MS)和固相微萃取，气相色谱-质谱联用(SPME，GC-MS)对精油和精油蒸气的成分进行分析，发现精油蒸气中富含某种单萜烯［3，12-13］。一般认为，抑菌物质需要有效的成分和作用方式才能获得好的抑菌效果，而蒸气态下的抑菌分子可以与靶细胞直接作用，从而产生抑菌效果。蒸气态分子具有较强的疏水性，同微生物的疏水性细胞膜有较强的吸引作用。当精油分子溶解在固体或液体食品中时，它会与溶质和离子相互作用，或多或少地被水分子包围，降低了疏水性。而精油分子在蒸气状态的疏水性较之在水中时大大增强，且几乎不与水发生溶合，从而促使精油分子包络、分割并穿透细胞［14］。因此，蒸气态精油分子的抑菌活性更高。

精油蒸气的抑菌效果还取决于微生物的种类和精油分子的蒸气压。革兰氏阴性菌具有外膜(由脂多糖构成)，可以防止外源物侵入细胞，因而对精油蒸气有更好的抗性。此外，精油蒸气的活性受到精油成分的化学性质及其蒸气压的影响。Tyagi等(2010)发现在液态和蒸气态时，柠檬草精油的活性大于薄荷醇精油，桉树精油最差。这些精油的主要活性成分分别是柠檬醛、薄荷醇和1-8，桉叶素［12-15］。早期的研究表明，肉桂醛和柠檬醛等醛类蒸气具有很强的抑菌活性，萜醇类(如薄荷醇)蒸气的抑菌活性中等，酮式萜烯和萜醚类(如1-8，桉叶素)蒸气的抑菌活性很差［16］。Caccioni等(1997)和 Gardinie 等(2011)均发现了顶部空间蒸气压会影响精油及其挥发性分子的抗真菌活性［4-5］。精油分子的蒸气压受到温度和水分活度等环境因素影响，可以通过控制环境因素来提高其抑菌活性［5］。因此，只有联系精油的物理状态(蒸气压)，才能对精油蒸气的抑菌性能做出更为系统的评估。

2 精油蒸气在食品保藏中的应用

目前，精油蒸气较多地与各种食品包装结合使用，该法最大的优点是将精油蒸气应用在食品包装中，避免抗菌剂集中在食品表面，既减少对食品感官的影响，又不妨碍食品的食用。植物精油及其组成成分属于天然提取物，依据欧盟决议2002/113/EC被分类到香料，在美国被美国食品与药品管理局(FDA)认证为GRAS物质，具有较高的食用安全性，但由于其成分复杂，很难制定针对于精油的统一标准。欧洲议会和理事会颁布的指令2004/1935/EC规定，每一种从包装中迁移到食品中的物质都须符合食品添加剂通用指令89/107/EEC。因此，凡是符合2004/1935/EC相关标准精油活性包装均可投入商业使用。此外，欧盟(EC)No 1334/2008法案规定禁止向食品中直接添加胡薄荷酮，异茴香醚，豆香素等芳香物质，因此对于含有以上成分的精油应限制其应用。我国GB9685-2008《食品容器、包装材料用添加剂使用卫生标准》对于食品容器、包装材料用添加剂的使用亦做出了具体规定。

食品包装中，选择合适的基质成膜，对提高精油蒸气的抑菌性能非常重要，因为挥发性物质在薄膜中释放的水平会受到聚合物基质的显著影响。Nerin团队促进了抑菌包装的发展，使其达到了与离体试验相似的抑菌水平。Lopez等(2007)发现混合了肉桂精油或牛至精油的聚丙烯(PP)薄膜较聚乙烯/乙烯-乙烯醇共聚物(PE/PVOH)薄膜具有更好的抗真菌性能，进一步的迁移实验证明，这样的食品包装符合2002/72/EC 的规定［6］。Rodriguez等(2007)发现，在富含肉桂醛的肉桂精油涂层纸包可以阻止蒸气渗漏并防止真菌污染［17］。此外，涂层中活性成分的浓度以及活性成分的表面浓度也是影响包装抑菌性的关键因素。Rodriguez等(2008)评估了以肉桂为基本成分的固体蜡活性包装对面包的保护效果，发现6%的肉桂精油可以完全抑制Rhizopus stolonifer［18］。此外，精油蒸气与气调包装相结合可以延缓甜樱桃和葡萄等多种水果的货架品质［19-21］。

精油蒸气可以在不与表面直接接触的情况大范围地作用于产品，从而使暴露于其中的产品不易腐败。将水果在储存和运输期间直接暴露于精油蒸气中，不但能降低水果在颜色和香味方面的感官影响，还能给予水果抑菌性保护。Wang等(2003)将采摘下的覆盆子和猕猴桃与精油蒸气直接接触，发现其易腐性显著降低［22］。Tzortzakis(2007)将水果(草莓和番茄)在储存和运输期间暴露于桉树/肉桂精油蒸气中，在保证水果的颜色和香味不受影响的前提下，起到了很好的防腐保鲜效果［23］。

3 空气负离子的抑菌活性研究进展

空气负离子对食品腐败菌的抑菌研究尚处在起步阶段。尽管早期研究发现带电的空气负离子对P.notatum，Neurospora crassa，Serratiamar cescens和Staphylococcus albus的生长有抑制作用［24-27］，但是由于实验设计方法的不统一，有关空气负离子抑菌作用的研究进展十分缓慢。直到1990年代后期，人们才利用更新、更系统的策略来确定空气负离子的抑菌活性。Shargawi等(1999)将接种了Candida albicans的琼脂培养基暴露在连接有空气负离子发生器的真空灌中，发现在O3存在的情况下空气负离子的抑菌效果更好。因此他提出在空气离子化过程中，氧化剂和超氧离子自由基的存在是空气负离子抑制微生物活性的重要原因［28］。Fletcher等(2007)将7种细菌暴露在空气负离子中，发现其中6种细菌细胞死亡的原因是暴露在 O3中，只有 Mycobacterium parafortuitum是由于暴露在电场中产生电穿孔而死亡［29］。Fan等(2002)同样发现空气负离子和O3具有良好的协同效应［30］。

空气负离子的抑菌机理研究还处于早期阶段，其主要作用机制是对细胞的破坏作用。细菌细胞的表面性质和生理条件(如生长环境、菌龄和环境的应激因素)，均能影响空气负离子的抑菌活性。Digelet(2004)利用十二烷硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳实验提出，氢氧根离子聚集在细菌表面导致细胞表面的蛋白质被等离子束破坏，最终使细菌死亡［31］。Tyagi等(2008)发现空气负离子对Escherichia coli和Pseudomonas fluorescens的抑菌效果与它们的生理状态以及与空气负离子的空间关系有关［32］。Fan等(2006)亦报道了空气负离子对于苹果片和绿豆等食品基质上的病原菌的抑菌效果［33］。这些研究建立了空气负离子在现实生活中应用的平台。

4 空气负离子在食品保藏中的应用

空气负离子能在空气消毒、病害防治和食品加工等行业发挥作用。静电电荷系统(electrostatic space charge system，ESCS)能显著减少不锈钢表面的微生物负荷，有望成为许多食品/禽类制品加工领域的补充处理技术。以正负离子的应用为基础的新型空气净化和杀菌技术(等离子束技术)在近几年有了很大发展［34-36］。介质阻挡光栅放电，使呈烟雾状散开的细菌短期暴露，正是这种直接的暴露使得空气中的细菌显著减少。蔡蕊(1999)通过环境隔离柜的方法来确定空气负离子器是否能通过减少环境控制隔离柜中空气灰尘和其他粒子的含量来影响肠炎沙门氏菌的空气传播，最终结果表明放置离子器的组中菌的传播较之未放置离子器的组有所减少［37］。其他研究还发现，空气负离子的存在使得空气中的粉尘、其他颗粒性物质和后续沉淀带电，从而减少了细菌在空气中的传播［38］。

空气负离子发生器在预防果蔬腐烂和减少环境微生物上有巨大的潜能，但是真正要实现商业化运用，还存在一定缺陷［39］。高浓度的空气负离子能抑制微生物的活性，但不同的微生物对该系统的应答也各不相同［40］。而且，空气负离子发生器能引起电离器自身邻近表面和接地部件处潜在感染性颗粒的积累，甚至造成一些病害的局部爆发［41］。因此，空气离子应当与其他抗菌剂结合使用，才能更有效的进行食品的防腐保鲜。

5 精油蒸气结合空气负离子的抑菌活性研究进展

精油蒸气和空气负离子结合使用时，不但抑菌活性更高，而且都可以不接触食品，从而把对食品品质的影响也降低到最低。这种结合最初是通过精油蜡烛中释放出来的扩散性电离产物来实现的［42］。在蜡烛产生的活性挥发电离产物中发现了橙皮油和百里香油，它们单独使用时几乎没有抑菌性，但与空气负离子结合时具有协同作用［43］，这项新技术可以显著降低物质表面的细菌总量［44］。

空气负离子能提高精油蒸气对微生物细胞的杀死作用。空气负离子由自由电子组成，自由电子与氧反应产生氧自由基，氧自由基再与精油的主要挥发性成分相互作用，从而增强细菌细胞壁的通透性，使得更多的细菌被杀死。Gaunt等(2005)发现空气负离子可以覆盖细菌的液膜，促进离子化精油分子的转移，并加强细胞膜间的联系［44］。Tyagi等(2010)报道了精油蒸气与空气负离子结合可以抑制P.fluorescens，延长冷藏果蔬的货架期［12］。4种精油(香茅、野薄荷、欧薄荷、蓝桉)分别与空气负离子结合，均能有效抑制液体或气体中的P.fluorescens。电子显微镜扫描结果显示，与精油蒸气或空气负离子单独处理相比，空气负离子与香茅蒸气或者薄荷蒸气相结合处理时的效果最好，4 h内P.fluorescens的细胞质全部流失，而空气负离子单独处理时细胞只出现局部变形;此外，空气负离子与柠檬草油蒸气结合使用时，对E.coli的抑菌性比单独使用空气负离子或者单独使用精油蒸气时的效果好［45］。

6 结论和未来展望

精油蒸气对一些食品中的微生物具有较好的杀菌作用，通过活性、改性气体包装或熏蒸剂进行水果防腐保鲜的应用前景非常看好，同时精油蒸气亦可减少生鲜产品在保温工具箱、纸板箱、盒子等商业环境中的腐败变质。在美国，通常认为精油或其成分都是安全的，欧洲法规也制定了明确的使用规则。亟待解决的是精油蒸气对食品感官的影响。

空气负离子作为抗菌剂的稳定性能和作用机理通过过去20年的研究已经初步明确。在防止果蔬腐败和医院或动物聚集地的感染性传播方面的应用前景也被看好。实验室的大规模研究也表明，精油蒸气暴露于空气负离子的情况下抑菌活性显著提高。开发空气负离子-精油蒸气设备，将会促进廉价，环保和高效的食品包装技术和空气净化技术的发展。

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