原发性干燥综合征外周血单个核细胞P2X7受体表达及其与焦虑、抑郁的相关性

2013-04-09谢斌华邬秀娣黄娴倩季蕴辛禹海航

中华临床免疫和变态反应杂志 2013年3期

谢斌华，彭　勇，陈　勇，张　顺，邬秀娣，张　振，黄娴倩，季蕴辛，禹海航

(宁波市第二医院风湿免疫科，宁波 315010)

原发性干燥综合征(primary Sjögren’s syndrome，pSS)是一种慢性、系统性自身免疫性疾病，其发病率为0.5%～5%，男女比例约为1∶9，发病机制不明。国内外研究均提示，少数pSS患者合并焦虑、抑郁等心理障碍[1-4]，且显著高于类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)患者及全部人群[2]。pSS和焦虑、抑郁等心理障碍之间是否存在联系值得引起临床关注。

嘌呤受体分为配体为腺苷酸的P1受体和配体主要为三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)的P2受体。P2受体又分为P2X受体和P2Y受体，其中P2X受体是一类配体门控非选择性阳离子通道嘌呤受体，目前已有7型P2X(P2X1-7)受体被克隆。相关研究证实，P2X7受体(purinergic P2X7receptor，P2X7R)可能通过ATP诱导促炎性细胞因子合成、凋亡、基因多态性等多重机制与自身免疫性疾病(如系统性红斑狼疮及RA等)[5-6]及焦虑、抑郁等心理障碍[7]的发病过程或病理生理相关。大量研究提示，P2X7R下游信号传导与促炎性级联反应耦联，P2X7R主要表达于单核巨噬细胞、淋巴细胞及脑内小胶质细胞，并与其释放成熟的促炎性细胞因子，如白介素(interleukin，IL)-1β及IL-6等有关[8-9]。

本研究针对pSS患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)上P2X7R的表达情况及其相关促炎性细胞因子(IL-1β、IL-6)水平进行研究，并量化评估上述指标与pSS患者合并焦虑、抑郁等心理障碍的相关性，从而探讨pSS患者PBMC上P2X7受体的表达情况及其与焦虑、抑郁的相关性。

对象和方法

研究对象

pSS组：选择2012年1月至9月在宁波市第二医院确诊的pSS患者，诊断符合2002年修订的干燥综合征国际分类标准，且排除其他潜在的自身免疫疾病、感染、恶性肿瘤等疾病。

阳性对照：选取同时期同医院确诊的未合并干燥综合征的RA患者作为RA组，以及同时期宁波市康宁医院神经症科确诊的、排除自身免疫性疾病的、焦虑和(或)抑郁患者作为焦虑抑郁组。

阴性对照：选取宁波市第二医院健康职工(包括退休职工)20名为健康组。

所有化验样本的取得都事先取得了受试者的同意。

心理评估量表

汉密尔顿抑郁量表和焦虑量表用于评估受试对象是否存在焦虑和(或)抑郁及其程度。评定时间范围设为过去1周内。由2名经培训的医师采用交谈与观察的方式进行检查，结束后2名评定者分别独立评分后取均值。汉密尔顿抑郁量表超过17分评定为抑郁，小于7分为无抑郁症状；焦虑量表总分超过14分评定为焦虑，小于6分为无焦虑症状。

PBMC分离

抽取受试者空腹静脉血(约3ml)于肝素抗凝的真空采血管中，用Ficoll-hypague(GE，USA)密度梯度离心法分离收集PBMC，并在Hanks平衡盐液(Hyclone，USA)中洗涤2次。用含有10%热灭活的胎牛血清(Hyclone，USA)、2mM L-谷氨酰胺及100 Uml青霉素和100 μgml链霉素的RPMI-1640液(Hyclone，USA)作为完全培养基重悬细胞。收集得到的PBMC用于P2X7受体表达流式细胞分析。

P2X7受体表达流式细胞分析

将上述完全培养基重悬的PBMC(1×106ml)分成2份，在其中1份中加入3 mM ATP，均在37℃5% CO2培养箱中孵育过夜，用Hanks平衡盐液洗涤1次。用PE-耦联的抗CD14(BD Bioscience，USA)及FITC-耦联的抗P2X7(Sigma，USA)标记，用PE耦联的IgG1(BD Bioscience)及全IgG抗体(Sigma，USA)作为同型对照。细胞悬液与抗体充分混匀，4℃避光静置30 min。Hanks平衡盐液洗涤2次后重悬细胞。用流式细胞仪(Beckman Coulter Epics XL，USA)对上述细胞进行上样分析。流式细胞上样分析方案见图1。

酶联免疫吸附检测技术测定IL-1β、IL-6

抽取受试者空腹静脉血于肝素抗凝的真空采血管中，留取1 ml离心1 000g×5 min，取血浆在-20℃冻存，备测。在1.5 ml EP管中加入200 μl上述抗凝新鲜全血，加入200 μl上述RPMI-1640培养基，并加入100 ngml脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)(Sigma，USA)和3 mM ATP(Sigma，USA)，并在37℃5% CO2培养箱中孵育2 h。离心1 000 g×5 min，取上清液在-20℃冻存，备测。用双抗体夹心酶联免疫吸附检测技术检测上述细胞培养上清液中的IL-1β和IL-6。采用杭州联科生物人IL-1β和IL-6酶联免疫吸附检测技术试剂盒，严格按照试剂盒说明书操作。

统计学处理

采用SPSS17.0软件，连续数据根据各测量结果的离散程度决定由四分位数范围或(均值±标准差)表示。连续数据符合正态分布则进行均数比较，否则采用非参数统计。均数比较两个独立样本采用t检验，两个以上独立样本采用单因素方差分析，两两比较用LSD检验；非参数统计两两比较采用Mann-Whitney U检验，两个以上样本采用Kruskal-Walli检验。双变量服从正态分布则采用Pearson相关分析，否则采用Spearman秩相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。

结　　果

一般情况

pSS组共纳入31例患者，其中男2例，女29例，年龄为23～81岁，平均年龄为(52.79±13.88)岁。阳性对照组中，RA组19例，其中男3例，女16例，年龄为43～78岁，平均年龄为(61.33±10.19)岁；焦虑和或抑郁组18例，其中男2例，女16例，年龄为33～66岁，平均年龄为(51.38±8.74)岁。健康组20名，男2例，女18例，年龄为34～71岁，平均年龄为(51.36±10.63)岁。各组年龄和性别构成差异均无统计学意义(P>0.05)。

P2X7受体表达

pSS组、RA组、焦虑抑郁组、健康组的PBMC表面均有P2X7受体表达。ATP刺激较未刺激，仅pSS组CD14+PBMC(主要为单核细胞)表面P2X7受体表达显著增高(t=3.647，P=0.001)；在CD14-PBMC(主要为淋巴细胞)表面，P2X7受体表达在pSS组(t=4.908，P<0.001)及焦虑抑郁组(t=3.412，P=0.003)均显著增高(表1)。

ATP刺激后，pSS组CD14+PBMC表面P2X7受体表达显著高于RA组(P=0.044)、焦虑抑郁组(P=0.004)及健康组(P=0.002)；在CD14-PBMC表面，pSS组P2X7受体表达较RA组(P=0.039)及阴性对照组(P<0.001)显著增高，而与焦虑抑郁组差异无统计学意义(P=0.126)；其余各组两两比较差异均无统计学意义(均P>0.05)(表1)。

无论ATP是否刺激，同时存在焦虑和抑郁的pSS患者CD14-PBMC表面P2X7受体表达显著高于无焦虑和抑郁的pSS患者(ATP刺激时P=0.003，无刺激时P=0.009)(表2)。

IL-1β及IL-6测定

PBMC培养上清液在无LPS及ATP刺激时，各组几乎均未检测出IL-1β。刺激后各组均检测出IL-1β，在LPS和ATP刺激2 h后，pSS组IL-1β水平显著高于RA组(Z=-2.560，P=0.010)、焦虑抑郁组(Z=-2.109，P=0.035)及阴性对照组(Z=-2.244，P=0.025)，其余各组两两比较差异均无统计学意义(均P>0.05)(表2)。

无LPS及ATP刺激时，阴性对照组IL-6水平显著低于pSS组(Z=-2.521，P=0.012)、RA组(Z=-3.724，P<0.001)及焦虑抑郁组(Z=-2.406，P=0.016)；RA组IL-6水平较pSS组(Z=-2.647，P=0.008)及焦虑抑郁组(Z=-2.347，P=0.019)均显著增高；pSS组与焦虑抑郁组比较差异无统计学意义(Z=-0.074，P=0.941)。LPS及ATP刺激2 h后，各组IL-6水平显著高于未刺激前水平(Z=-6.793，P<0.001)，但刺激后各组IL-6水平差异无统计学意义(χ2=0.778，P=0.855)(表3)。

表1　流式细胞仪检测外周血单个核细胞表面P2X7受体表达Table 1　Expression of P2X7 receptor on peripheral blood mononuclear cells by flow cytometry　[%，(均数±标准差)]

ATP：三磷酸腺苷；pSS：原发性干燥综合征；RA：类风湿关节炎；a显著高于RA组(P=0.044)、焦虑抑郁组(P=0.004)、健康组(P=0.002)；b显著高于RA组(P=0.039)及健康组(P<0.001)，但与焦虑抑郁组比较差异无统计学意义(P=0.126)；cATP刺激与无刺激CD14+P2X7表达之差；dATP刺激与无刺激CD14-P2X7表达之差；e单因素方差分析

表2　原发性干燥综合征患者外周血单个核细胞表面P2X7受体表达Table 2　Expression of P2X7 receptor on peripheral blood mononuclear cells in patients with primary Sjogren’s syndrome　(均数±标准差)

ATP：三磷酸腺苷；*单因素方差分析；NA：未测出

讨　　论

早在1988年，国外学者的研究就表明pSS患者有明显焦虑、抑郁等严重的精神症状[1]。随后欧美等国的小规模研究均提示，pSS患者合并焦虑、抑郁等心理障碍的发生率明显增高[2]。我国也有研究提示，49%的pSS患者存在焦虑，30%的pSS患者合并抑郁[3]。2009年美国Barbara等[4]的大规模研究也证实了上述研究结果。本研究采用了汉密尔顿焦虑、抑郁量表进行评价，也得到了相似结果。

本研究显示，ATP刺激较未刺激，pSS患者外周血CD14+PBMC(单核细胞)表面P2X7受体表达显著增高，而对于健康组，其表达的差异并无统计学意义；ATP刺激后，pSS患者外周血CD14+PBMC(单核细胞)表面P2X7受体表达较健康组显著增高；进而提示，与RA患者、焦虑抑郁患者及健康人相比，pSS患者单核细胞对ATP的刺激更为敏感。在LPS存在的条件下，ATP刺激外周血后上清中IL-1β、IL-6显著增高，提示嘌呤受体(特别是P2)可能与外周血细胞释放成熟的促炎性细胞因子IL-1β、IL-6有关。而ATP刺激pSS患者外周血后，其上清中IL-1β水平与CD14+PBMC表面P2X7受体表达呈显著正相关，进而提示单核细胞表面的P2X7受体可能参与了IL-1β的释放。也就是说，ATP刺激后pSS患者除了单核细胞P2X7受体表达量增高外，其功能也增强。

表4　ATP刺激后CD14+外周血单个核细胞表面P2X7受体表达与pSS临床参数的相关性Table 4　Correlation between the expression of P2X7 receptor on ATP stimulation CD14+ peripheral blood mononuclear cells and clinical parameters in pSS

IL：白介素；ATP：三磷酸腺苷；pSS：原发性干燥综合征；a脂多糖及ATP刺激2 h

P2X7受体除了与免疫紊乱相关外，还与心理障碍有关。其被认为是神经精神和免疫系统联系的一个关键因子[7]，焦虑、抑郁等心理障碍的发病机制可能涉及P2X7受体。Basso等[11]研究提示，P2X7受体敲除的小鼠在悬尾实验和强迫游泳实验显示出抗抑郁样行为。Boucher等[12]研究表明也证实这一关点。编码P2X7受体的P2X7基因位于染色体12q24.31，该区域是抑郁和焦虑障碍的重要遗传区域，提示其可能与情感障碍有关[13]。基因图谱和连锁不平衡分析显示，P2X7基因中Gln460Arg单核苷酸多态性有抑郁和双相情感障碍的易感性，量化的病例对照研究也提示其与抑郁障碍相关[14]。

激活的P2X7受体所致细胞因子释放可能参与了焦虑、抑郁等心理障碍的发生发展。一方面，一些针对细胞因子的研究提示，焦虑、抑郁等心理障碍普遍存在细胞因子紊乱。Song等[15]发现，抑郁症患者血清IL-1β水平显著增高，抗抑郁治疗后其水平减低。Boufidou等[16]研究提示，妇女脑脊液IL-6水平与产后抑郁有关。大量的动物实验也提示这一关点。促炎性细胞因子IL-1β及IL-6能够导致动物出现明显的抑郁样行为，而IL-1受体敲除的小鼠未诱导出焦虑样行为[17]，IL-6敲除的小鼠亦未因应激而导致抑郁样行为[18]。另一方面，动物实验证实，在LPS刺激下P2X7受体敲除的小鼠脑内小胶质细胞分泌IL-1β明显减少[19]。

本研究结果提示，与健康组相比，无论是pSS患者还是焦虑抑郁患者血浆中IL-6水平均显著增高。在LPS存在的条件下，ATP刺激后外周血中IL-1β、IL-6显著增高。ATP刺激较未刺激，pSS患者及焦虑抑郁患者外周血CD14-PBMC(主要为淋巴细胞)表面P2X7受体表达显著增高。ATP刺激后，pSS患者外周血CD14-PBMC表面P2X7受体表达较RA患者及健康人显著增高，而与焦虑抑郁患者相比其表达差异无统计学意义。无论ATP是否刺激，同时存在焦虑和抑郁的pSS患者CD14-PBMC表面P2X7受体表达显著高于无焦虑和抑郁的pSS患者。ATP刺激后，外周血CD14-PBMC表面P2X7受体表达与焦虑、抑郁评分呈显著正相关。无ATP刺激，其表达与焦虑评分呈显著正相关。进而提示pSS患者及焦虑抑郁患者外周血CD14-PBMC(主要为淋巴细胞)对ATP刺激更为敏感。

P2X7受体可能通过活化后调节促炎性细胞因子、基因多态性等参与pSS患者及其合并焦虑抑郁状态的发病机制及病理生理。这一结论提示，一方面或可通过动物实验等检测ATP刺激前后脑内小胶质细胞上P2X7受体表达情况，进而研究其与焦虑、抑郁等心理障碍的相关性；另一方面或可将P2X7基因作为研究位点，分析pSS患者的基因多态性，进而研究其与合并焦虑、抑郁等心理障碍的相关性。

综上所述，pSS和焦虑、抑郁等心理障碍存在着明显的共病倾向。无论是pSS患者还是焦虑、抑郁等心理障碍的患者都存在免疫紊乱，而P2X7受体则被认为是神经精神和免疫系统联系的关键因子。P2X7受体可能涉及pSS混着及其合并焦虑、抑郁等心理障碍的发病机制或病理生理，而其中促炎性细胞因子IL-1β等可能发挥着重要作用。进一步研究其机制对于揭示pSS及其合并心理障碍的发病机制、寻找新的治疗靶点都具有积极意义。

(本文图1见封3)

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