人脐血CD34+造血干细胞的分离和体外扩增培养问题

王丹丹，贺雪萍，武文杰，李 茜，韩俊领

(协和干细胞基因工程有限公司，吉林长春300384)

干细胞(Stem Cells，SC)是一类多潜能细胞，还未充分分化，具有较强的自我复制能力。有研究表明脐带血中含有大量的干细胞，无论是对外界刺激的反应还是增殖能力都比骨髓干细胞强。在体外生长培养中也显示出优于骨髓干细胞的特点，比骨髓干细胞生长的更好，即更适合做体外扩增培养。本文通过对人脐血CD34+造血干细胞的分离以及体外培养的研究，探讨其作为治疗用种子细胞的可能性，现将研究结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 UCB来源:人脐带血由相关医院妇产科提供。

1.1.2 仪器和药品:使用的主要仪器包括细胞培养箱，超净工作台;细胞培养板，流式细胞仪;显微镜，照相机;电子天平，离心机;低温冰箱等。

使用的药品主要包括细胞因子 SCF、IL－3、IL－6、GCSF、EPO;青霉素、链霉素;NaCl、KCl;甲醇、乙醇;Na2HP04、KH2P04;Ficoll淋巴细胞分离液;胎牛血清;DMEM培养液。1.2 方法:采用胎盘娩出后采血法采集脐带血，要求孕妇无产科，内科合并症以及其他血液疾病。采血过程由助产士帮助完成。在无菌条件下抽取脐带血，注入无菌采血袋后置于4℃保存。24 h内分离制备MNC悬液后用Isolex50免疫磁珠分离系统收集CD34+造血干细胞，用流式细胞仪检测收集的CD34+纯度后行体外扩增培养。通过血液涂片进行形态学观察。根据细胞计数调整细胞悬液量，加入胎牛血清和DMEM溶液。在24孔培养板上做5组不同细胞因子组合的培养孔，以不加细胞因子的培养孔作为生长对照，每组重复三次，共培养6周。每周计数单个核细胞数和集落形成单位(CFU)。细胞因子分组为:(1)SCF+IL－3+IL－6;(2)SCF+IL－3+G－CSF;(3)SCF+IL－6+G－CSF;(4)SCF+IL－3+IL－6+G－CSF;(5)SCF+IL－3+IL－6+G－CSF+EPO。其中浓度分别为:SCF 100 ng/mL、IL－3 10 ng/mL、IL－6 50 ng/mL、G－CSF 80 ng/mL、EPO 2U。

1.3 数据分析:用SPSS 13.0软件对数据进行统计学分析，对数据进行卡方检验。剂量资料采用平均数标准差表示。P＜0.05表明差异具有统计学意义。

2 结果

经流式细胞仪检测，在分离后的细胞中CD34+造血干细胞占(81.31±4.57)%。在体外进行的细胞培养，其增殖能力有明显差别。本研究中使用细胞因子的细胞培养孔的单个核细胞数明显大于无细胞因子的细胞培养孔(P＜0.05)。此外，不同的细胞因子组合对扩增细胞的总数也有显著的影响和差异，其中以第5种组合5种细胞因子联合培养组单个核细胞增殖倍数最高，集落形成单位(CFU)形成率最高(P＜0.05)。结果显示人脐血CD34+造血干细胞体外培养第13 d时达到高峰。

3 讨论

脐带血，指的是胎儿娩出、脐带结扎并离断后，残留在脐带内以及胎盘近胎儿侧血管内的血液，其中含有大量干细胞，包括造血干细胞和间充质干细胞等。干细胞具有较强的自我复制能力。胚胎干细胞在一定的环境条件下可以分化为多能干细胞。造血干细胞是多能干细胞的一种，是骨髓中的干细胞，它具有自我更新的能力，也能够分化成为各种血细胞前体细胞并最终分化为各种血细胞，如红细胞、白细胞和血小板。脐带血可以重建骨髓造血和人体免疫，多用来治疗骨髓衰竭以及严重的血液疾病，在一些遗传病和严重的免疫缺陷疾病中也被广泛应用，并且获得了一定的成功。有研究表明脐带血中含有大量的干细胞，无论是对外界刺激的反应还是增值能力都比骨髓干细胞强。在体外生长培养中也显示出由于骨髓干细胞的特点，比骨髓干细胞生长的更好，即更适合做体外扩增培养［1］。脐带血不仅含有丰富的干细胞，其分泌生长因子的能力也很强。此外，其端粒酶活性也远远高于骨髓和外周血干细胞，这些特点导致了脐带干细胞扩增会有更强的分裂存活能力。

造血生长因子分为刺激增殖的刺激因子和维持细胞存活的存活因子。根据各种生长因子的不同功能，合理搭配可以起到协同作用。本研究结果表明SCF、IL－3、IL－6、GCSF、EPO5种细胞因子联合应用诱导CD34+造血干细胞体外扩增培养效果最好，且CD34+造血干细胞体外培养第13 d时达到高峰。目前，脐带血造血干细胞的研究有不少成果，但至今成功移植的例子却很有限。一方面是因为干细胞的数量较少;另一方面则是由于脐带干细胞移植入成人骨髓的成功率较低［2］。所以，如何提高脐带血造血干细胞的移植成功率，如何在体外扩增和培养脐带血造血干细胞就成为了研究的热点，也是其进一步发挥于临床医学应用所要面对的重要挑战。

［1］ 刘琰，华锌，卯国强.人脐带血细胞体外扩增的实验研究和意义［J］.中华器官移植杂志，2001，22:336－338.

［2］ 罗伟琼，陈慧珍，黄春柳，等.脐血采集方法、影响因素分析及注意事项［J］.临床和实验医学杂志，2010，6(1):63 －64.