真菌生物膜耐药机制研究进展

赵 卉，廖 勇，杨蓉娅

1 真菌生物膜感染的重要性

免疫缺陷状态、广谱抗生素的使用、手术造成黏膜屏障的破坏、放疗和化疗、肠外营养以及留置导管的广泛应用，使得真菌已成为重要的院内感染相关病原菌。念珠菌已成为院内重症监护患者菌血症的第三大常见病原菌，也是真菌相关生物膜感染的最常见病原菌。白念珠菌细胞黏附于留置医疗器械表面，形成生物膜结构，并引起真菌血症及播散性感染；这种植入物相关感染很难根治，需要通过移除植入物和长期的抗真菌治疗才能达到满意疗效。此外，光滑念珠菌，近平滑念珠菌，克柔氏念珠菌及热带念珠菌也可以引起导管相关医源性和医疗植入物相关感染[1]。其他真菌也可以引起生物膜相关感染，包括球孢菌属、曲霉菌属、接合菌属、芽生裂殖菌属、马拉色菌属、毛孢子菌属和隐球菌属等[2]。

随着研究的深入，科学家逐渐发现不同种类的真菌均具有形成生物膜的能力。通过对白念珠菌生物膜的研究，对真菌生物膜形成过程中的分子机制也有了一定认识[1,2]。病原真菌生物膜的形成是目前临床抗真菌治疗反应不佳的重要原因，而清除生物膜所需抗真菌药的血药浓度却远超出了临床治疗的上限。

2 生物膜基础研究

细菌和真菌均可在单个分散游离状态与固着多细胞群落状态间相互转换，后者通常就是生物膜状态。生物膜是一种附着于介质或细胞间相互黏着的高度结构化细胞群落，由其自身产生的细胞外基质所包裹[2]。环境中约80%的微生物存在于生物膜群落中，微生物形成生物膜可以使其适应环境，抵抗各种外源性应激、压力，提高代谢的协同作用。近年来，真菌生物膜的致病性日益受到临床关注。生物膜不仅可以为其提供庇护（特别是对抗真菌药物的耐受性[2]），也为微生物的持续性感染创造条件，且涉及越来越多的免疫缺陷人群[1]。真菌生物膜的形成是一个连续过程，包括黏附于介质表面、形成微菌落、细胞外基质的分泌、微菌落融合形成生物膜、生物膜成熟、真菌细胞从生物膜中释放出来、形成新的生物周期。病原真菌细胞常常黏附和定植于留置导管、植入物及黏膜的表面，包括周围基质（尿液、血液、 唾液和黏液）的化学成分、流动性、pH 值、温度、渗透压、细菌、抗感染药物以及宿主的免疫状态等，多种因素影响真菌生物膜的形成与成熟[3]。

3 生物膜耐药性研究

早期对生物膜耐药性的研究是通过对其基本表型水平的描述性分析来评价抗真菌药物的作用。干重法、四氮唑溴盐（MTT）还原反应、亮氨酸掺入法及静态和动态模型可用于研究白念珠菌生物膜活力及生物膜对抗真菌药敏感性的变化[4]。但上述模型构建繁琐，因此，高效快速的二甲氧唑黄（XTT）比色法开始逐步应用于酵母菌的黏附力和药敏的研究[5]。但XTT 比色法对生物膜的特征不能进行量化分析，因此，这种方法仅适用于直接的、孤立的、未经处理的对照研究，而非绝对定量分析生物膜形成本身。Martinez 和 Casadevall[6]于2006 年开发了一种基于微量滴定板来检测新生隐球菌生物膜对药物的敏感性。96 孔微量培养板已用于曲霉生物膜的药敏检测，XTT 简化法和阿拉马蓝法用于研究分生孢子、菌丝的耐药性[7]。

生物膜周围液体的流动性可以改变其对药物的敏感性[4]，越来越多的流体生物膜模型体系被构建并用于生物膜的研究[3]。Lopez Ribot 研究小组最近研究了一种简单的以重力为基础的流体真菌生物膜模型，构建的生物膜较厚且对多烯类和棘白菌素类抗真菌药的耐药性更强。此外，目前已经构建了许多用于体内研究的生物膜模型，包括皮下植入模型、静脉导管模型、阴道模型及义齿模型[7],这有助于进一步研究真菌生物膜的体内耐药性。

4 真菌生物膜耐药机制

对抗真菌药物的耐药性是生物膜的重要特征。研究显示，真菌生物膜比浮游细胞耐药性高1 000 倍左右，但其耐药机制尚未完全阐明[8]。尽管一些抗真菌药物（棘白菌素和脂质体两性霉素B）能够抑制真菌生物膜，但生物膜复杂结构所致的内源性耐药机制有待于进一步研究[9]。真菌对抗真菌药物的耐药较复杂，可以是化合物的诱导反应，或对抗真菌药的长期暴露引起的不可逆转的遗传学变化。抗真菌耐药机制包括靶分子的改变或过度表达，流出泵的外排，细胞外基质的分泌，应激反应及细胞密度升高等。

4.1 生长条件

菌群的生长环境特征影响着生物膜的药物敏感性。葡萄糖和铁离子使白念珠菌生物膜对两性霉素B 的耐药性升高[10]。此外，在缺氧状态下形成的白念珠菌生物膜对两性霉素B 和唑类抗真菌药物具有较高的耐药性。pH值、温度、氧气及环境变化等其他影响因素都会影响生物膜的结构及对抗真菌药的敏感性[6]。在pH 为7.0 的中性环境中，白念珠菌黏附聚苯乙烯表面的能力更强[6]，与在YNB 中形成的生物膜相比，在RPMI1640 培养基中形成的生物膜对卡泊芬净更加耐受。有研究显示，念珠菌可以在厌氧环境（如牙周袋）及缺氧条件下形成生物膜，并导致多种感染[11]。

4.2 细胞密度

酵母状态和丝状结构并存的生物膜菌群中，细胞密度是生物膜产生耐药性，特别是对唑类药物耐药的重要因素。游离细胞和重悬的生物膜细胞在低细胞数量（103个/ml）时对唑类药物敏感，当细胞密度增长后耐药性也随之增加[12]，这种现象在烟曲霉生物膜中也可观察到。生物膜耐药性的调控通路尚不清楚，且棘白菌素类药物具有较强的抗生物膜作用，也说明细胞密度的影响是有限的[13]。此外，与浮游细胞相比，生物膜重悬分离细胞仍具有一定耐药性，说明生物膜还存在其他耐药机制[7]。

4.3 药物靶点的过度表达

唑类药物对白念珠菌的抑制作用引起了菌群的自然选择可达到诱导耐药作用。ERG11 基因的点突变（S405F，Y132H，R467K 和G464S 突变）或过度表达与其耐药的关系比较明确[14]。通过基因芯片对白念珠菌的研究发现，其生物膜状态CaERG25 和CaERG11 基因出现过度表达[15]。生物膜的早期和晚期麦角固醇生物合成相关CaERG1，CaERG3，CaERG11 以及 CaERG25 的表达上调可以导致真菌对氟康唑耐药。特别是22 h 生物膜形成后，CaSKN1 及CaKRE1 的中度上调可导致生物膜对两性霉素B 耐受[16]。同样，近平滑念珠菌生物膜中也出现了麦角固醇合成基因的表达上调，以及对唑类药物的耐受。

4.4 药物外排泵

ABC 转运蛋白超家族（ATP-binding cassette transporter superfamily，ABC）和易化载体蛋白超家族（major facilitator superfamily，MFS）是白念珠菌对唑类耐药的主要机制[17]。多种抗真菌药均可以作为这两种转运蛋白的底物，它们的过度表达可导致不同药物之间的交叉耐药性，特别是唑类药物。生物膜对棘白菌素类抗真菌药物的敏感性也受到外排泵的影响[18]。生物膜药物外排泵基因包括CaCDR1、CaCDR2 和CaMDR1[19]，在生物膜形成过程中均有表达，特别是在暴露于抗真菌药后出现表达上调。在生物膜形成的24 h 和48 h，CaCDR1 和CaCDR2 的表达出现上调，CaMDR1 在第24 h 出现短暂上调[20]。动物研究表明,植入导管相关生物膜也有外排泵基因的表达[16]，在12 h，CaCDR2 转录基因上调1.5 倍，CaMDR1 在12 h 和24 h 分别上调2.1倍和1.9 倍[15]。对光滑念珠菌的研究发现，在生物膜形成的早期(6 h)、中期(15 h)及晚期(48 h)，CgCDR1 和CgCDR2 均有表达。与浮游细胞相比，CgCDR1 上调1.5 ～3.3 倍，CgCDR2 上调0.5 ～3.1 倍[21]。另一项研究发现，在生物膜形成晚期，药物外排泵的缺失可以导致白念珠菌生物膜耐药性降低[12]。

4.5 细胞外基质

细胞外基质（extracellular matrix，ECM）是真菌生物膜的重要特征，帮助细胞对抗宿主免疫系统和抗真菌药物所致损害[3]。ECM 阻止或延迟了药物的渗入，最新的研究显示ECM 的化学成分及其调控机制在生物膜耐药过程中发挥重要作用[22]。β-1,3 葡聚糖是碳水化合物主要组成部分，可以通过抑制1,3-β-D-葡聚糖合成酶，从而抑制生物膜的形成[4]。此外，β-1,3 葡聚糖酶可明显增加氟康唑和两性霉素B 的活性。外源性给予生物膜ECM 和β-1,3 葡聚糖可降低氟康唑体外抗真菌活性。研究表明，β-1,3 葡聚糖可以螯合唑类抗真菌药物，称之为“药物海绵”，是白念珠菌生物膜耐药的重要原因[23]。此外，β-1,3 葡聚糖还与棘白菌素类，嘧啶类和多烯类抗真菌药物的耐药性有关。白念珠菌ECM 的产生受到多方面调控，ECM 不仅是白念珠菌生物膜也是非白念珠菌生物膜，如光滑念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌和都柏林念珠菌产生耐药性的重要因素。

4.6 应激反应

应激反应已被证实是抗真菌药耐受的重要机制。病原真菌需要面对多种来源的生理应激，包括温度、离子、渗透压和氧化应激[14]，这些应激原与不同的受体结合，通过传统信号通路引起反应,通过应激反应参与生物膜的形成。此外，与野生型和游离菌株相比，Mck1p 基因突变株对唑类药物敏感，表明Mck1p 通过应激通路参与生物膜的耐药性。钙调神经磷酸酶是白念珠菌对唑类耐药的关键，钙调神经磷酸酶与体内外生物膜对唑类抗真菌药物耐受的调节作用有关[24]。热休克蛋白90(Hsp90)通过复杂的细胞通路对真菌生物膜进行调节，并增强了白念珠菌生物膜对唑类和棘白菌素类抗真菌药物的耐受，其中部分是通过钙调神经磷酸酶起作用[25]。Hsp90 可以物理性地催化钙调神经磷酸酶的亚基，且保持其稳定及其活性。Cowen 和Lindquist[25]以及Singh 等[26]通过研究发现，Hsp90 基因的缺失抑制了白念珠菌生物膜的生长和体外细胞的成熟，并引起生物膜细胞的离散，同时降低白念珠菌生物膜对唑类抗真菌药的耐受。烟曲霉Hsp90 的缺失会导致生物膜对棘白菌素类抗真菌药物的耐受性降低[27]。此外，光滑念珠菌生物膜蛋白质组的研究表明，热休克蛋白12（Hsp12p）和其他反应蛋白质（Trx1p，Pep4p）的表达上调也与生物膜耐药性相关[28]。

5 总结

真菌生物膜的耐药机制由复杂的、多种机制共同参与，包括一些基本的物理性屏障作用和一些复杂的调控过程。外排泵主要在生物膜形成的早期到中期逐渐发挥作用，后期ECM 的产生也增强了生物膜的耐药性。成熟而致密的生物膜形成的物理屏障和环境压力下的低生长代谢率均有利于生物膜的生存。此外，致密生物膜可以抑制抗真菌药物的渗透，菌丝生长及麦角固醇同样影响生物膜的耐药性，环境中应激反应蛋白质发挥着保护和维持生物膜稳定性的作用。总体而言，生物膜耐药性是受多方面调控的动态平衡的过程。

[1] Ramage G, Martinez JP, Lopez-Ribot JL. Candida biofilms on implanted biomaterials; a clinically significant problem [J].FEMS Reast Research, 2006, 6(7):979-986.

[2] Ramage G ,Mowat E, Jones B, et al. Our current understanding of fungal biofilms [J]. Crit Rev Microbiol, 2009, 35(4):340-355.

[3] Ramage G, Wickes BL, Lopez-Ribot JL. A seed and feed model for the formation of Candida albicans biofilms under flow conditions using an improved modified Robbins device [J]. Rev Iberoam Micol, 2008, 25(1):37-40.

[4] Hawser SP, Baillie GS, Douglas LJ. Production of extracellular matrix by Candida albicans biofilms [J]. J Med Microbiol, 1998, 47(3):253-256.

[5] Hawser SP, Norris H, Jessup CJ, et al. Comparison of a 2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)carbonyl]-2H-t etrazolium hydroxide (XTT) colorimetric method with the standardized National Committee for Clinical Laboratory Standards method of testing clinical yeast isolates for susceptibility to antifungal agents [J]. J Clin. Microbiol, 1998, 36(5):1450-1452.

[6] Martinez LR, Casadevall A.Susceptibility of Cryptococcus neoformans biofilms to antifungal agents in vitro [J]. Antimicrob Agents Chemother, 2006, 50(3):1021-1033.

[7] Rajendran R, Mowat E, McCulloch E, et al. Azole resistance of Aspergillus fumigatus biofilms is partly associated with efflux pump activity [J]. Antimicrob Agents Chemother, 2011, 55(5):2092-2097.

[8] Di Bonaventura G, Pompilio A, Picciani C, et al. Biofilm formation by the emerging fungal pathogen Trichosporon asahii: development, architecture, and antifungal resistance [J]. Antimicrob Agents Chemother, 2006, 50(10):3269-3276.

[9] Mowat E, Lang S, Williams C, et al. Phase-dependent antifungal activity against Aspergillus fumigatus developing multicellular filamentous biofilms [J].J Antimicrob Chemother, 2008, 62(6):1281-1284.

[10] Baillie GS, Douglas LJ. Iron-limited biofilms of Candida albicans and their susceptibility to amphotericin B [J]. Antimicrob Agents Chemother, 1998, 42(8):2146-2149.

[11] Kumar CPG , Menon T. Biofilm product ion by clinical isolates of Candida species [J]. Med Mycol, 2006, 44(1):99-101.

[12] Perumal P, Mekala S, Chaffin WL. Role for cell density in antifungal drug resistance in Candida albicans biofilms [J]. Antimicrob Agents Chemother, 2007, 51(7):2454-2463.

[13] Cocuaud C, Rodier MH, Daniault G, et al. Anti-metabolic activity of caspofungin against Candida albicans and Candida parapsilosis biofilms [J]. J Antimicrob Chemotherapy, 2005, 56(3):507-512.

[14] Cannon RD, Lamping E, Holmes AR, et al. Candida albicans drug resistance another way to cope with stress [J]. Microbiology, 2007, 1539(10):3211-3217.

[15] Garcia-Sanchez S, Aubert S, Iraqui I, et al. Candida albicans biofilms: a developmental state associated with specific and stable gene expression patterns [J]. Eukaryotic cell, 2004, 3(2): 536-545.

[16] Nett JE, Lepak AJ, Marchillo K, et al. Time course global gene expression analysis of an in vivo Candida biofilm [J]. J Infect Dis, 2009, 200(2):307-313.

[17] 廖勇, 敖俊红, 杨蓉娅. 病原真菌外排转运蛋白与真菌耐药的研究进展 [J]. 实用皮肤病学杂志, 2011, 4(4):215-218.

[18] Niimi K, Maki K, Ikeda F, et al. Overexpression of Candida albicans CDR1, CDR2, or MDR1 does not produce significant changes in echinocandin susceptibility [J]. Antimicrob Agents Chemother, 2006, 50(4):1148-1155.

[19] Lepak A, Nett J, Lincoln L, et al. Time course of microbiologic outcome and gene expression in Candida albicans during and following in vitro and in vivo exposure to fluconazole [J]. Antimicrob Agents Chemother, 2006, 50(4):1311-1319.

[20] Ramage G, Bachmann S, Patterson TF, et al. Investigation of multidrug efflux pumps in relation to fluconazole resistance in Candida albicans biofilms [J]. J Antimicrob Chemother, 2002, 49(6):973-980.

[21] Song JW, Shin JH, Kee SJ, et al. Expression of CgCDR1, CgCDR2, and CgERG11 in Candida glabrata biofilms formed by bloodstream isolates [J]. Med Mycol, 2009, 47(5):545-548.

[22] Douglas LJ. Penetration of Candida biofilms by antifungal agents [J]. Methods Mol Biol, 2009, 49(9):37-44

[23] Nett JE, Sanchez H, Cain MT, et al. Genetic basis of Candida biofilm resistance due to drug-sequestering matrix glucan [J]. J Infect Dis, 2010, 202(1):171-175.

[24] Uppuluri P, Nett J, Heitman J, et al. Synergistic effect of calcineurin inhibitors and fluconazole against Candida albicans biofilms [J]. Antimicrob Agents Chemother, 2008, 52(3):1127-1132.

[25] Cowen LE, Lindquist S. Hsp90 potentiates the rapid evolution of new traits: drug resistance in diverse fungi [J]. Science, 2005; 309(5744):2185-2189.

[26] Singh SD, Robbins N, Zaas AK, et al. Hsp90 governs echinocan-din resistance in the pathogenic yeast Candida albicans via calcineurin [J]. PLoS Pathog, 2009, 5(7):e1000532.

[27] Robbins N, Uppuluri P, Nett J, et al. Hsp90 governs dispersion and drug resistance of fungal biofilms [J]. PLoS Pathog, 2011, 7(9):e1002257.

[28] Seneviratne CJ, Wang Y, Jin L, et al. Proteomics of drug resistance in Candida glabrata biofilms [J]. Proteomics, 2010, 10(7):1444-1454.