茶尺蠖病毒研究进展

王定锋，王庆森，吴光远

（福建省农业科学院茶叶研究所，福建 福安 355015）

茶尺蠖（Ectropis obliquaProut）隶属鳞翅目（Lepidoptera）尺蛾科（Geometridae），又名茶尺蛾，俗称拱拱虫、量寸虫、吊丝虫，分布于我国各主要产茶区，年发生代数多（约6代），产卵量大，常在局部茶园暴发成灾，是我国茶树的主要害虫之一。主要以幼虫取食嫩叶和成叶，发生严重时可将茶树食成秃枝，对茶叶产量、品质和茶树树势影响较大，对夏、秋茶为害最重。除危害茶树外，还可危害大豆、豇豆、芝麻、向日葵等[1-3]。尽管农业防治和物理防治在茶尺蠖的防治中有采用[4-6]，但更多的还是使用农药防治，特别是化学农药[6-7]。化学农药的长期大量使用，造成茶叶农药残留超标、害虫产生抗药性和环境污染等问题，正日益受到人们的重视。昆虫病原微生物具有对靶标害虫专一、不伤害天敌和环境友好等优点，是害虫综合治理（Integrated Pest Management，IPM）的重要组成部分。本文就病毒的研究与应用进展进行综述，为更好地发掘、开发和利用这类病原因子提供参考。

1 茶尺蠖核型多角体病毒

隶属于杆状病毒科（Baculoviridae）A亚组的茶尺蠖核型多角体病毒（Ectropis obliqueNuclear Polyhedrosis Virus,EoNPV）对茶尺蠖幼虫具有较高的致病力，可长期存在于茶园生态系统中，是该系统中制约茶尺蠖自然种群发展的重要病原微生物[8]。

1.1 EoNPV生物学特性

1977年赵烨烽等[9]在我国首次发现茶尺蠖病毒病的流行，并初步推断致病因素是一种核型多角体病毒，而后朱国凯等[10]经过鉴定进一步确认该病毒为核型多角体病毒。毛迎新[11]等应用分子生物学技术明确了EoNPV湖北分离株是不同于安徽分离株的一个新的地区分离株。长期以来，国内研究人员对EoNPV的形态学[12-13]、血清型[14]、毒性[8,15]和安全性[8,16-17]等生物学特性以及EoNPV对茶尺蠖幼虫取食、生长发育的影响[18-19]及田间种群的控制[20]做了大量的研究，为进一步开展病毒的检测、剂型的开发以及田间施用情况奠定了基础。叶恭银[21]等开展了3种主要环境因子（温度、紫外线和茶园露水）对茶尺蠖核型多角体病毒毒力的影响，结果表明适于病毒感染各龄幼虫的温度范围是 18～26℃；紫外线对离体病毒的影响与温度及病毒浓度有关；而茶园露水对离体病毒无明显影响。殷坤山[22]等试验表明茶尺蠖核型多角体病毒对高温和紫外较敏感，但对pH适应范围较宽。

1.2 EoNPV的扩繁

病毒的大量扩繁是实现病毒制剂规模化生产和田间大面积示范推广的先决条件，但病毒的扩繁却受环境温度[23-25]、饲毒浓度、寄主龄期[23]和寄主规模化饲养程度等条件的制约。吴晓晶[23]等研究表明，饲毒浓度是影响EoNPV产量的最主要因子，其次是饲毒时寄主幼虫的虫龄，在25℃，光暗比为9﹕15（h）时病毒产量最高；叶恭银、胡萃[24-25]研究表明，26℃适于茶尺蠖核型多角体病毒（EoNPV）的增殖和病毒形态的正常发生。唐美君[26]研究表明在24℃下条件下用5×l05PIB/ml病毒液浸渍的叶片喂养茶尺蠖3龄中期幼虫，病毒的产量最高，可达6.02×108PIB/头。在明确病毒增殖影响因素的基础上，室内大规模饲养茶尺蠖以便进行活体繁殖病毒是当前面临的最大难题之一。不少研究者对茶尺蠖人工饲料配方及室内饲养条件进行了一系列的研究[27-31]，从虫源选择、饲料配方筛选和饲养条件入手，初步解决了茶尺蠖在冬季与早春因饲料不足导致继代饲养困难的难题，为提供相同虫龄的试脸材料以及增殖病毒的虫源，打下基础。尽管如此，茶尺蠖室内大规模饲养仍然面临规模较小而不能满足大量病毒增殖的问题。郭睿[32]等则通过基因工程技术构建了感染茶尺蠖后可以扩增的重组家蚕核型多角体病毒（rBmNPV）为利用家蚕作为宿主来生产重组病毒杀虫剂奠定了基础。

1.3 EoNPV制剂的研发与应用

我国研究者通过一系列室内试验和田间实践，不断改进、完善EoNPV制剂。殷坤山等详细介绍了适合基层茶场实际操作的茶尺蠖核型多角体病毒土法生产技术[33]；并在研究茶尺蠖病毒杀虫剂田间使用技术后，提出要抓住茶尺蠖第1、2代和第5、6代的1～2龄幼虫期[34]。洪北边等筛选出具有一定抗紫外能力的茶尺蠖核型多角体病毒制剂EoNPV2H2和EoNPV2H4[35]，并开展了2种制剂的室内和田间防治试验，均取得了较好的效果[35-36]。叶恭银等研究发现EoNPV病死虫匀浆稀释液抗紫外线能力最强，而加苋菜红食品染料的提纯病毒次之，在此基础上筛选出适于高温季节的茶尺蠖核型多角体病毒制剂EoNPV-Ⅰ乳剂，对茶尺蠖3龄初幼虫杀虫活性达 89.04%[37]。胡萃等从健虫饲养、病毒增殖、病毒提取和病毒贮存四个方面详细介绍了茶尺蠖核型多角体病毒的生产工艺流程[38]。为了适应生产与市场需求，陈华才等研制了3种EoNPV制剂（EoNPV 乳剂、EoNPV-Bt乳剂、EoNPV-溴氰可湿性粉剂），并证实这3种制剂在室内和田间对茶尺蠖的防治效果均在90%以上，此外，还进行了大面积的示范应用，取得了较高的经济和生态效益[39]。为明确不同地理种群的茶尺蠖对EoNPV的敏感性存在较大差异的现象，席羽等对不同地理区域的茶尺蠖种群，进行了病毒毒效和毒力的生物测定，明确了茶尺蠖不同地理种群对EoNPV病毒的敏感性存在显著差异，这为后续开展其机理研究及应对策略提供基础[40]。

在EoNPV制剂使用过程中，研究者还开展了EoNPV与农药混配的研究，以便提高杀虫效果。叶恭银等研究表明杀灭菊酯和硫酸铜对EoNPV具有一定的增效作用[37]。商建农等研究发现EoNPV与敌灭灵、哇硫磷混用无增效作用[41]。徐健等的研究表明，Bt与EoNPV混配具有增效作用，并研制发出茶尺蠖病毒 Bt制剂尺蠖清（1.0×107 PIB/mLEoNPV + 2000 IU/mg Bt），大面积应用对茶尺蠖防效可达92.4%，对茶园其它鳞翅目害虫（茶毒蛾、刺蛾和茶银尺蠖等）兼治效果达60%以上，保叶率达92.1%，而且对茶园天敌没有杀伤作用[42-43]。殷向东等则研究了Bt与EoNPV混配的理想配比，为配比的最佳性判别建立了较为系统而可靠的基础，具有很好的应用价值[44-45]。

1.4 EoNPV定性、定量检测技术的建立

随着茶尺蠖病毒在茶园中的大面积推广应用，研究该病毒的感染和复制机制及在自然界的流行规律，建立快速、稳定、灵敏度高、特异性强而又安全的检测方法至关重要。张永安等建立了基于茶尺蠖EoNPV多角体蛋白基因的PCR检测技术，可以灵敏的检测茶尺蠖子代卵和蛹中EoNPV的存在[46]。杜军利等初步建立了茶尺蠖核型多角体病毒荧光定量 PCR检测方法[47]，随后袁志军等对该检测方法进行了优化，使该方法能定性定量检测茶尺蠖核型多角体病毒类生物农药以及监测病毒对茶尺蠖的感染过程[48]。杜军利等还制备能特异地与EoNPV病毒粒子蛋白结合的EoNPV的单克隆抗体，并建立了基于此单抗的ELISA检测方法，从而提供了更为准确快速的EoNPV检测技术[49]。而谭荣荣等利用提纯的茶尺蠖核型多角体病毒蛋白，制备其特异性多克隆抗体，建立Indirect-ELISA检测方法，为进一步研究该病毒的血清学特性及建立高通量、快速的病毒检测技术奠定基础[50]。

1.5 重组NPV病毒的研究

随着对EoNPV分子生物学研究的深入，以及全基因组测序工作的完成，为利用基因工程技术改造菌株奠定了坚实的基础[51-52]。为提高杀虫速率，扩大杀虫谱，林晨构建了包含茶尺蠖几丁质合成酶（Chitin synthase，CS）CS1保守基因双链干涉序列的重组 NPV病毒，并证明了重组病毒杀虫效率明显高于野生型出发菌株（尤其对低龄幼虫），而且对蚕和石榴尺蠖也具有一定的杀虫活性[53]。为了解决茶尺蠖饲养复杂而导致茶尺蠖核型多角体病毒（EoNPV）繁殖困难，郭睿等通过基因工程技术拓展了家蚕核型多角体病毒（rBmNPV），使经家蚕扩增后的 rBmNPV重组菌株能够感染茶尺蠖并在茶尺蠖体内扩增，该研究为利用家蚕作为宿主来生产重组病毒杀虫剂奠定了基础[32]。

2 茶尺蠖小RNA病毒

王小纯等报道从茶尺蠖虫尸上分离纯化到一株新的非包涵体病毒，茶尺蠖小RNA病毒（Ectropis obliquapicorna-like virus）[54-55]，并对该病毒基因组结构进行了分析[56-57]。林美娟等构建了茶尺蠖小RNA病毒全长 cDNA克隆，为从分子水平研究EoPV病毒生物学特性、病毒复制机理等奠定了基础[58]。Cheng等研究揭示了茶尺蠖小RNA病毒的2C蛋白RNA螺旋不稳定和链退火加速活性，这可能是茶尺蠖小 RNA病毒复制和发病机理的关键，这些结果对我们理解小RNA病毒和病毒RNA分子伴侣有重要意义[59]。此外，武汉大学还以茶尺蠖核型多角体病毒和茶尺蠖小 RNA病毒为主体构建了茶尺蠖双病毒复合杀虫剂，充分兼容了2种病毒的杀虫优势，具有一定的应用前景。

3 讨论

茶尺蠖核型多角体病毒是一种高效、安全的生物农药，但由于其利用害虫活体扩繁的特点，目前其生产规模仍然受限于茶尺蠖室内规模化饲养阶段。虽然前期已经开展了大量茶尺蠖室内饲养的研究[23-31]和利用基因工程技术构建以家蚕作为宿主进行扩繁的重组病毒[32]，但在实际操作中还未能真正解决茶尺蠖大量饲养的难题。因此，今后有必要从虫源的选择、人工饲料配方和室内饲养条件的优化等几个方面进一步研究茶尺蠖大量饲养的问题，以便满足EoNPV商业化生产的需要。此外，茶尺蠖小RNA病毒虽然在分子生物学方面开展了大量的工作[56-59]，但在病毒扩繁、剂型开发及田间施用方面的研究还鲜有报道，今后可开展相关的研究，以便更好地应用于生产实践。与化学杀虫剂相比，茶尺蠖病毒存在杀虫速度慢、杀虫谱窄、受环境因子影响较大等弊端。在筛选出高毒力病毒毒株的基础上，除了优化剂型配制外，利用基因工程技术来改良病毒毒株，可以获得杀虫毒力更强和杀虫谱更宽的重组毒株[53]，通过改变宿主范围来解决大量扩繁问题的重组毒株[32]以及具有更好环境适应性的重组毒株。虽然利用基因工程技术改良的病毒毒株可以更好地满足生产上的需要，但目前还缺乏关于重组病毒毒株对环境的安全性评估的相关报道，这也是今后有待深入研究的内容。

前人已经开展了大量EoNPV与其它农药混用的试验[37,41-45]，针对茶尺蠖的防治药剂也在不断更新，所以有必要适时开展新型防治药剂与EoNPV混用的试验，以满足生产上的实际需求。

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