PCR技术对侵袭性真菌感染诊断的研究进展＊

毛晓露，石小燕综述；卢忠心，胡丽华审校

（1.武汉市中心医院检验科，武汉430014；2.武汉市中心医院中心实验室，武汉430014；3.华中科技大学同济医学院附属协和医院检验科，武汉430022）

侵袭性真菌病（invasive fungal disease，IFD），又称侵袭性真菌感染，是真菌侵入人体组织和血液，并在其中生长繁殖导致组织损害、器官功能障碍和炎症反应的病理、生理过程。近年来，由于环境因素的危害和药物因素影响（如免疫移植、肿瘤放化疗、大剂量广谱抗生素的长期使用、糖皮质激素和免疫抑制剂的广泛应用等），造成了IFD的患病率和病死率均呈显著上升趋势。免疫力低下的IFD患者大多病情凶险，常无特征性临床表现，易被原发病或继发细菌、病毒感染掩盖，且对传统抗真菌药物的敏感性降低，故临床早期诊断非常困难，后期治疗十分棘手。真菌感染的检测技术，目前以人工镜检、培养和组织病理检查等传统方法分析为主，但这些方法检测时间较长、敏感性较低且受主观因素影响较大。因此，快速检测此类病原菌是治疗和改善预后的关键。聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）技术具有快速、简便、敏感性和特异性高等优点，在一定程度上可以弥补传统方法的不足。本文就其在IFD快速诊断的研究进展及临床应用远景进行综述。

1 PCR技术在诊断曲霉病中的应用

由曲霉属真菌感染引起的疾病包括过敏性支气管肺曲菌病、肺曲霉球病和侵袭性曲霉病（invasive aspergillosis，IA）。血液和肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage，BAL）是临床检测的常规标本。最近研究表明，大量血清和BAL沉渣与少量血清和经离心BAL的上清液相比，更容易检出真菌病原体［1］。采用实时定量PCR检测血液和BAL标本进行IA诊断分析有助于节省检测时间，可在物种水平鉴定基础上更有针对性地进行抗真菌药物治疗，具有较好的临床应用价值，并建议对PCR技术进行标准化［2］。虽然PCR标准化有利于诊断性能的验证，但仍存在一些问题，如DNA的提取效率提高至多少可以增加诊断的敏感性，哪类临床标本更能有利于指导临床诊断以及血中何种组分含有最多真菌DNA等。

2 PCR技术在诊断念珠菌病中的应用

念珠菌是人体黏膜最常见的共生菌，也是免疫功能低下患者感染最常见的真菌病原体。约50%的感染由白色念珠菌引起，其他几种念珠菌也可引起侵袭性疾病，如近平滑念珠菌、热带念珠菌、都柏林念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、葡萄牙念珠菌等。由于念珠菌属的基因决定了对不同抗真菌药物敏感性有所不同，尽快正确鉴定念珠菌种属以采取适当的药物治疗对提高临床疗效和降低病死率非常重要。通过血培养检测念珠菌的敏感性通常较低（大约为50%或更低），其他基于抗原、抗体和代谢物的念珠菌检测技术都有各自的优势和价值，但缺乏特异性和敏感性。PCR检测提供了一个快速诊断并正确鉴定念珠菌到达种属水平的方法。念珠菌是口腔和上呼吸道的共生体，呼吸道标本可能被念珠菌污染。因此，从呼吸道标本分离出的念珠菌，包括支气管镜检查和BAL（甚至标本保护刷）的试样，在没有病原菌入侵的活检证据时不考虑诊断为IFD。在BAL中检测到高水平的念珠菌可建议诊断为念珠菌性肺炎，尽管这种临床实例非常罕见。血液标本由于最可能包含循环中完整有机体形式或细胞外形式的真菌DNA而作为首选的临床检测标本。最近有研究对104例确诊为非中性粒细胞减少患者的全血与血清进行了PCR检测分析，结果显示血清的阳性率可达100%，而全血的阳性率只有70%，这表明血清比全血具有更高的敏感度［3－4］。

Morace等［5］分别用PCR和血培养方法检测全血及血清中的念珠菌，结果显示PCR技术具有更高的敏感性。Ahmad等［6］报道了通过半套式PCR检测念珠菌rRNA基因操纵子的转录间隔区（internal transcribed spacer，ITS）可鉴别混合念珠菌感染，而这种双重感染通过培养不易检出，特别是当某一种菌株的增长速度显著增高时检测更加困难。Dunyach等［7］对两种实时PCR检测方法的灵敏度进行了评估，一种是针对5种念珠菌的ITS区域，另一种是将18SrRNA作为目的基因，均通过熔融曲线形态来进行分析。结果表明，ITS扩增长度的变异可导致分析灵敏度发生相应变化，后者具有更高的灵敏度。

Maaroufi等［8］分别用血培养和实时定量PCR方法对69例临床确诊或疑似系统性念珠菌感染患者的血液标本进行了检测，结果显示两种方法的敏感性和特异性几乎相当。该PCR检测方法采用了两种可变的水解探针，一种是只针对白色念珠菌的6－羧基荧光素（FAM）标记探针，另一种是针对五大主要念珠菌的四氯－6－羧基荧光素（TET）标记探针。两种探针诊断的敏感性均为100%，特异性分别为97%和72%［9］。此外，这两种探针与人类rRNA基因的部分序列具有相似性，与其他生物体如曲霉属、酵母菌和镰刀菌等均有显著的交叉反应。由于念珠菌与许多其他常见的病原体相比，属系发育更多样化［10－12］，评估探针特异性以及引物和探针相互杂交的可能性是关键因素。此外，选择合适的标本种类和提高核酸提取效率也非常重要［13－15］。

3 PCR技术诊断真菌感染的广谱筛查

混合真菌感染（尤其在抗真菌治疗）时，由于主菌的过度生长，其他菌可能不易被检测到。念珠菌属的系统发育具有多样性，对不同抗真菌药物敏感性也有所不同。多重PCR在检测真菌混合感染中可发挥重要作用。并非所有的病原真菌可以通过培养迅速繁殖，故阴性测试结果不能排除真菌感染的可能性［16］。广谱PCR检测的引物是针对该分类单元中所有生物体的高度保守基因序列。例如，广谱细菌PCR检测引物的特异性是针对细菌高度保守基因16SrRNA或RNA聚合酶基因序列［17］。这些基因几乎存在于所有细菌，且都包含与广谱引物作用理想的保守区和有利于确定物种的可变区序列。从理论上讲，广谱真菌PCR检测可以实现大多数真菌病原体的检测，将其与其他方法如熔融曲线分析相结合，可快速进行物种鉴定［18］。

PCR扩增可以针对真菌rRNA基因操纵子的ITS1区，并进行测序，以确认物种的身份。为鉴别临床相关真菌病原体，除ITS的rRNA操纵子以外，18SrRNA基因与28SrRNA基因的高变序列D1－D2区也常作为PCR检测的靶基因［19］。最近有研究表明，28SrRNA基因中D1－D2区以外的序列也可用于广谱真菌PCR的检测［20］。虽然大多数广谱真菌PCR的研究都集中在有曲霉菌和念珠菌属感染的患者，而Khot等［21］成功鉴别了多种真菌，包括念珠菌、隐球菌、孢霉菌、曲霉菌、镰刀菌、丝孢菌属、外小杯菌、明脐菌属、鳞质霉属、放射毛霉属和根霉菌属。如果以培养和组织病理学方法作为金标准，其结果准确率分别为93.6%和64.3%。

与特定病原体属种的PCR检测相比，广谱PCR检测IFD的诊断特异性可能由于假阳性率（false－positive，FP）较高而有所下降［22－24］。除了污染，FP较高可能由定植于采样点的共生真菌引起，也可能由缺乏准确的IFD临床分类标准造成。提高广谱真菌PCR产物的物种鉴定水平是促进解析假阳性结果的关键因素。

PCR技术是诊断IFD的主要方向，但是如何继续发展，目前有两种观点。第一种观点认为，已经开发了通过PCR诊断真菌感染所需的大部分专有技术，现在是进行大规模临床检测验证时期。第二种观点则认为，需要做更多的研究，以对临床样本进行优化选择、进一步改善样本的收集和处理以及DNA提取方法、加强PCR检测技术的质量控制等，以最大限度地提升诊断特异性，有效提高诊断效率。高分辨率的熔融温度分析已广泛用于种属特定PCR或广谱真菌PCR检测，微球杂交技术如液相芯片技术等将更广泛地用于PCR产物的物种水平鉴定和质谱分析［25］。无论是单重PCR反应还是多重PCR，将重点探讨发展可用于诊断混合感染的分析方法，实时定量模式将成为真菌靶向检测的规范。

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