实验犬放射性心脏损伤模型建立与评价1）

宋建波，闫 蕊，侯彦杰，张国良，鄢 敏，李思进

放射性心脏损伤（Radiation induced heart disease，RIHD）是由胸部肿瘤放疗引起的迟发性不良反应之一。20世纪90年代临床回顾研究发现乳腺癌和霍奇金淋巴瘤等恶性肿瘤患者放疗后心脏病病死率明显高于正常人，这一问题逐渐引起放疗专家广泛关注［1，2］。以往文献报道的动物模型大多采用小鼠、大鼠或兔子等，本研究选用实验犬作为研究对象，由于其心脏解剖结构与人相似，不容易死亡，并可以行影像学检查等特点，可为后续研究提供稳定可靠的实验动物模型。

1 材料与方法

1.1 动物处理 取健康成年雄性1岁龄比格犬8只，体重（12.00±0.67）kg，安徽省阜阳市维光实验动物中心提供，中国辐射防护院动物中心对实验犬标准化饲养，试验中所有麻醉剂均使用戊巴比妥钠。

1.2 PET／CT代谢显像方法 显像剂18F-FDG由住友加速器（HM-10）全自动化合成，产物经过 HPLC分析，放化纯＞95%可以使用。实验犬禁食12 h后经静脉推注50%葡萄糖（1 g／kg），半小时后麻醉并静脉注射222 MBq 18F-FDG，静息45 min后行PET-CT显像（GE Discovery VCT）。首先以CT Scout像定位心脏，并以心脏为中心扫描，先行CT扫描，然后使用3D心电门控模式数据采集，矩阵128×128，采集时间约为10 min。之后1周行心肌照射，照射后3个月以上述相同方法行18FFDG显像。

1.3 照射方法 实验犬麻醉后取仰卧位真空垫体位固定，增强CT模拟定位扫描（GE Discovery VCT），照射结束后将图像传至Varian eclipse TPS系统，勾画左室前壁作为照射靶区，靶区约占左室室壁体积的1／4～1／3，制定调强放疗计划，照射剂量为单次20Gy。计划设计完成后，实验犬以模拟扫描相同体位在直线加速器（Varian Clinac IX）上进行摆位固定，锥形束CT（CBCT）扫描进行位置验证，位置验证合格后执行照射，射线能量为6MV-X线。

1.4 图像处理和分析 使用同机CT数据对PET图像进行衰减校正、图像重建和融合后将数据传至Xeleris 4.3工作站进行图像分析，结果判断由两位有经验的核医学医师双盲法阅片，比较照射前后心肌代谢变化情况。分别在前壁照射区和侧壁、间壁非照射区勾画感兴趣区（ROI）并测定标准化摄取值（SUV），做放疗前后照射区／非照射区（SUVig／SUVnig）定量分析。

1.5 病理学检查 常规麻醉后用10%KCl 5 m L心腔直接注射处死动物，肉眼观察心肌变化情况，取照射区与非照射区心肌浸于3.7%福尔马林液中，择期石蜡包埋切片病理观察心肌血管损伤情况，行HE染色，用光学显微镜以不同倍数观察。

2 结 果

2.1 一般情况 8只比格犬均完成整个实验过程，放疗前后饮食、体重、毛发色泽及精神状态无明显变化。放射治疗过程顺利，在线CBCT分析误差均未超过5 mm。

2.2 心肌18F-FDG代谢情况

2.2.1 图像分析 放疗前8只比格犬心肌摄取18F-FDG均匀清晰，未观察到明显放射性摄取增高减低区。放疗后3个月心脏摄取18F-FDG不均匀，左心室前壁及心尖部放射性节段性摄取增高，水平轴重建并与CT融合后可观察到与放射靶区一致的摄取增高区。

2.2.2 SUVig／SUVnig定量分析 照射后实验犬左心室前壁和心尖照射区标准化摄取比值均大于照射前，照射前后SUV比值差异有统计学意义（P＜0.001）。详见表1。

表1 实验犬照射前后SUVig／SUVnig比值

2.3 病理学结果 处死实验犬暴露心脏后肉眼观察，8只实验犬均可见照射区外表苍白，一只出现心包积液，一只照射区局部心包粘连，横断切开心肌，可见照射野处质硬，呈灰白瘢痕状，病理观察照射区心肌可见退变及局灶性坏死，血管肿胀，周围向外渗透，与未照射区有明显差异。病理HE染色与未照射区相比，照射区心肌可见退变及局灶性坏死，血管肿胀，内壁不规整，周围向外渗透，有纤维形成。

3 讨 论

放射治疗是肿瘤治疗的主要手段，食管下端、纵隔、左侧乳腺等胸部肿瘤放疗过程中即使采用调强放射治疗、图像引导放疗等先进技术也不可避免会使心脏受一定程度照射。RIHD是一种远期副反应，症状主要表现在心包及心肌纤维化、加速冠状动脉粥样硬化形成、心脏传导阻滞及心瓣膜损伤［3］。已往多为放疗后患者随访研究，受个体差异、治疗方式、随访时间等多因素影响，而在实际临床工作中，很难将RIHD表现出来的临床症状与其他心脏疾病鉴别，目前尚没有对RIHD无创性早期检测的报告，有文献报道胸部放疗数月后照射野内心脏FDG摄取率增高，提示可能与心肌损伤相关［4］。但这些研究中患者肿瘤位置各异，心脏受照部位及剂量／体积不同，且部分患者接受了化疗以及伴有高血压、高血脂、吸烟等常规心脏疾病高风险因素影响，增加了分析研究难度。笔者在临床工作中也发现部分胸部肿瘤放疗后患者18F-FDG复查时心脏FDG分布不均，本实验便是尝试分析单因素心脏局部照射后病理改变与18F-FDG糖代谢变化情况，构建RIHD模型及无创评估方法，可为进一步研究RIHD提供良好的研究平台。

一直以来，用来研究RIHD的主要实验动物为啮齿类动物［5，6］，虽然易于获得，生命力顽强，费用少，但心脏体积太小，照射时很难将其分为照射区和非照射区，这样不利于对照研究；也有报道使用兔子作为研究对象［7］，由于兔子对实验条件要求较苛刻，死亡率高，易造成实验数据缺失；本研究以实验比格犬作为研究对象，由于其心脏与人解剖结构相似，不容易死亡，可以应用临床大型的医学仪器直接检测，更好地模拟人类的RIHD。RIHD动物模型制备放射剂量应大于20Gy，实验鼠研究表明，剂量取10Gy照射心脏损伤进展缓慢，虽有病理心肌损伤改变，但生存期内不出现心力衰竭症状；心脏受照剂量＞15Gy会引起有症状的心脏损伤，生存期内会出现充血性心衰；单次剂量20Gy照射可引起不可逆的心脏损伤，减少动物生存期。常用照射剂量为单次5 Gy～25 Gy照射或分次照射如9Gy／次×5次等，以单次照射常见，因为单次照射可以在较短时间内诱发与分次累积剂量照射等效的放射性损伤，有利于实验操作减少多次摆位误差并缩短实验前期的等待时间等优势。本实验照射采用CT模拟定位，图像引导放疗进一步保证了照射靶区的精确性，构建心脏局部放射损伤模型。

Lauk等［8］研究表明，放射导致微血管损伤主要源于放射线直接照射心肌内直径小于0.2 mm微血管的内皮细胞，引起毛细血管损伤，最终导致心脏和心肌纤维化。Fajardo等［9］研究表明辐射加速了粥样硬化斑块的形成，且随着照射剂量的增加，斑块内出血和炎性细胞浸润的几率增加，因此，更容易引起斑块破裂，血栓形成。本实验虽无动态观测病理，但3个月HE染色结果显示照射野小血管肿胀，内壁不规整有斑块形成，血管周围外渗有纤维形成，基本与同类报道类似。18F-FDG是一种葡萄糖的类似物，为目前应用最广泛的正电子显像剂，具有灵敏度、特异性好，临床检出率高以及可单次全身显像等优点，多用于肿瘤患者早期检出、规范分期、放化疗预后评价等，同时也被广泛应用存活心肌显像［10］。糖负荷下行照射后心肌18F-FDG显像，由于心肌照射区局部毛细血管损伤，影响心肌血供，限制脂肪酸代谢，无氧糖酵解增加，放射区域心肌摄取18F-FDG增加。所以对18F-FDG的摄取程度一定程度上可反映了该处心肌的损伤水平，可能作为RIHD无创性早期检测的手段。本研究便是基于该理论假设设计，实验结果显示照射后3个月实验犬前壁照射区心肌代谢增高，可发现与照射野一致的代谢增高区，验证了心肌18F-FDG显像可早期检测心肌辐射损伤。

综上所述，采用20Gy对实验犬心脏前壁照射可以成功构建局部RIHD模型，18F-FDG心肌代谢显像可作为无创性评价RIHD模型是否构建成功的检测手段，这将为进一步深入研究RIHD提供良好的研究平台。

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［2］ Hancock SL，Tucker MA，Hoppe RT.Factors affecting late mortality from heart disease after treatment of Hodgkin’s disease［J］.JAMA，1993，270：1949-1955.

［3］ Schultz-Hector S，Trott KR.Radiation-induced cardiovascular diseases：Is the epidemiologic evidence compatible with the radiobiologic data？［J］.Int J Radiat Oncol Biol Phys，2007，67（1）：10-18.

［4］ Jingu K，Kaneta T，Nemoto K，et al.The utility of 18F-fluorodeoxyglucose positron emission tomography for early diagnosis of radiation-induced myocardial damage［J］.Int J Radiat Oncol Biol Phys，2006，66（3）：845-851.

［5］ Kruse JJ，Zurcher C，Strootman EG，et al.Structural changes in the auricles of the rat heart after local ionizing irradiation［J］.Radiother Oncol，2001，58：303-311.

［6］ Boerma M，Zurcher C，Esveldt I，et al.Histopathology of ventricles，coronary arteries and mast cell accumulation in transverse and longitudinal sections of the rat heart after irradiation［J］.Oncol Rep，2004，12：213-219.

［7］ Tewart JR，Fujardo LF，Cohn KE，et al.Experimental radiation-induced heart disease in rabbits［J］.Radiology，1968，91（4）：814-817.

［8］ Lauk S，Kiszel Z，Buschmann J，et al.Radiation-induced heart disease in rats［J］.Int J Radiat Oncol Biol Phys，1985，11：801-808.

［9］ Fajardo LF.The pathology of ionizing radiation as defined by morphologic patterns［J］.Acta Oncolo，2005，44（1）：13-22.

［10］ 张晓丽，刘秀杰，吴清玉，等.18F-FDG心肌PET显像检测存活心肌的临床评价［J］.中华核医学杂志，1998（4）：196.