雄蜂精液储存

雄蜂精液储存

现在的蜜蜂育种工作面临着重要挑战，需要培育可以抵御引进的或以前未知的病原体及寄生虫的蜂种。同时，可利用的基因多样性在迅速下降，西方蜜蜂的亚种和生态型面临着外来基因型的大量渗入，发展实用的精液储存方法将可以提高育种者选择和保存优良蜜蜂种群的能力。目前已成功尝试了一些使用超低温冷冻及非冷冻技术储存精液的方法。

精液储存方法的成功性评估实验包括：依据精子活力评估精液质量、统计人工授精蜂王受精囊中的精子数以及比较已授精蜂王所产的工蜂蛹与雄蜂蛹的比例。Harbo还测量了卵的孵化率。不过，这些活体技术需要耗费大量时间和精力，有些试验还需要损失很多蜂王。一些研究者还对未稀释或轻微稀释的精液进行活力测量，发现冷冻-融解的精液与未冷冻精液无差别甚至优于未冷冻精液。

精液的有效储存技术必须满足精子存活的最低接受水平。为确定这一水平，Collins（2000）使用新鲜精液和冻死精液的不同比例的混合物对蜂王进行授精，授精后蜂王放入小群中。使用冻死精液（0%新鲜精液）进行授精的蜂王受精囊中无精子，只产雄蜂子。使用25-100%新鲜精液授精的蜂王受精囊中活精子和死精子的比例（由双荧光染色法确定）在授精后27天没有明显区别。使用含50%及以上新鲜精液进行授精的蜂王只产工蜂。所以，她认为精子储存应该达到50%的存活水平以保证精液的功能。

蜂王人工授精所用的精液通常是新鲜采集或在室温条件下保存不到一个星期。雄蜂精液在室温下最长大概可以储存两周。2000年，Collins测试了在非冷冻温度下精子存活的限度。收集的经稀释的精液储存在密封的毛细管中，放在室温下或12℃冰箱中放置一年。使用SYBR-14及碘化丙啶双荧光染色法测定精子存活情况：在最初6个周内精子存活没有明显变化。在6～9周，活精子的数量从80%下降到58%，此水平保持至39周。52周时，保存在室温下的精液活精子数下降到18.9%。非冷冻储存法可以进行短期的精液种质保存。根据体外精液的运动性和生存力对储存时间、雄蜂日龄和污染对精液质量的影响进行研究，分析了4个日龄组（1周、2周、4周及6周日龄）和5种储存时间（0、1、2、4和6周）。随储存时间延长，精液生存能力和能动性明显下降。但未储存的精液样品的运动模式明显比储存2周的精液低。随雄蜂日龄增加，精液生存力明显下降，但运动模式无改变。被外源颗粒或微生物污染的精液样品的平均生存力明显比未被污染的样品低。

精液储存实用技术的发展可以明显提高培育特定基因型及保持遗传多样性的能力。所以，精液的低温储存技术对蜜蜂保种和育种工作十分有益。但此类技术的发展受到蜜蜂繁殖生物学的阻碍。蜂王羽化出房后不久进行交配，精液储存在受精囊中，长达2～5年。这意味着冷冻与解冻的精液必须能在受精囊中长期储存并能产出数以万计的受精卵。

Harbo（1977）使用液氮储存的精液对蜂王授精，成功产下工蜂。低温保护剂为DMSO（二甲基亚砜）。使用精液混合物（60%精液，30%盐溶液，10%DMSO）授精的蜂王与对照组蜂王相比，受精囊中有41%的精液。不使用DMSO时，精液无存活。遗传标记显示蜜蜂精液在-196℃储存两年后可以产生后代，使用储存4天的精液对9只蜂王人工授精，产生22%的工蜂子（范围在8～55%之间），使用储存两年的精液对8只蜂王人工授精，产生8%的工蜂子（范围在1～25%之间）。

进一步的研究对此储存技术进行了改良，蜜蜂精液进行以下处理：（1）与10%的DMSO在盐溶液中进行稀释，储存在-196℃；（2）同样的处理，但储存在12℃；（3）在盐溶液中进行稀释，储存在12℃；（4）未稀释、未储存的精液。对各处理的子代蜂王进行不育性评估，含DMSO的两组中3%的蜂王产雄蜂卵（第一组为5/166，第二组为6/234），与第三组和第四组差异显著，后两组没有产生后代蜂王，只产雄蜂卵（分别为0/151和0/ 137）。结果显示，在相应实验条件下，DMSO引起较低的不育水平。

考虑到西方蜜蜂种内多样性所受的威胁以及抗病育种所受的压力，进行雄蜂精液冷冻保存技术研究十分重要。雄蜂精液最常使用的冷冻保护剂为DMSO，使用膜渗透性实验，Wegener和Bienefeld（2012）测量了4种可能的DMSO替代物1,3-丙二醇、2,3-丁二醇、乙二醇和二甲基甲酰胺的短期毒性。他们还检测了使用含低温保护剂的精液人工授精对蜂王受精囊中精子的数量或精子活力的影响。另外，还测试了DMSO和乙二醇混合物是否降低低温保护剂在活体内的毒性。结果显示，虽然低温保护剂的短期毒性都很低，但授精精液中单种低温保护剂的使用可大大降低到达蜂王受精囊中的精子数量。DMSO也有此效应。乙二醇还可降低到达受精囊的精子的活力。他们认为，过去低估了低温保护剂对蜜蜂精子和蜂王的毒性。

雄蜂精液的低温保存受多个因子影响：冷冻速率优化、融解速率优化、低温保护剂的性质和浓度以及稀释液的组成。Wegener等（2012）分析了7种体外测试与授精后精子性能的相互关系。测试包括：运动性、细胞构造、暴露于生理化学压力前后膜的渗透性。他们指出运动性测试结果和到达蜂王受精囊中的精子数量以及授精蜂王中可育卵子的比例明显相关（相关系数q分别为0.67和0.48）。传统的双荧光染色法和新的基于损伤细胞中磷酸葡萄糖异构酶（GPI）渗漏的测试也和到达蜂王受精囊中的精子数相关（q分别为0.54和0.61）。总的认为，运动性、双荧光染色和GPI-渗漏测试是提高蜜蜂精液低温保存的有用工具。

Hopkins和Herr（2010）研究了可能影响精子融解后活力的因子，包括低温保护剂的类型和浓度、冷休克的影响、冷冻速率和温度敏感性。他们分析了两种冷却速率：程序性冷却和快速冷却。程序性冷却是缓慢冷却样品，促使胞外结冰而有效使细胞脱水、防止细胞内结冰。而快速冷却是迅速降低温度、使细胞内外无法形成冰晶，最低冷却速率估计为30,000℃/min。这个最低冷却速率依赖于低温保护剂的类型和浓度。为了达到这一速率，样品必须很小，有足够的表面积。实验显示，使用含10%DMSO、缓慢冷却至结冰温度之上、以3℃/ min的速率进行冷却处理的精液活力较高（93%）。此方式冷却的精液和未冷冻精液相比，活力及能动性无明显差异。

丁桂玲 译