卵巢内生殖干细胞的研究进展和应用

李广莹，石 红

(大连医科大学 附属第一医院 妇产科，辽宁 大连116011)

雄性哺乳动物中，由于精原干细胞的存在，在整个生命周期中，精子可以不断地产生。但是，雌性个体出生后的卵巢中拥有固定的卵泡数目并且数量逐渐下降已获得普遍共识。早在1951年，卵巢功能不全及老化和损伤引起的不孕就表明出生后卵巢内的卵泡数不能自我更新［1］。但是近来，随着出生后卵巢中存在卵泡更新和生殖干细胞的相关研究结果的不断发表，这一认识正发生改变。

1 小鼠卵巢中生殖干细胞的发现

2004年，Johnson 等［2］首次报道，幼鼠及成年鼠卵巢中，具有有丝分裂活性的生殖细胞，并可持续更新卵泡池。他根据对卵巢中健康卵泡和退化闭锁卵泡的数量进行分析，认为根据出生后小鼠卵巢中卵泡的闭锁速率，卵泡理应很快消耗殆尽，而事实却与之相反，在13 ～14 个月龄的小鼠中才发生，非闭锁卵泡数目与闭锁速度相比下降较慢。对位于卵巢上皮层的大卵圆形细胞进行免疫组化分析及增殖标记(MVH、BrdU、SCB)染色分析使他们认为出生后的小鼠卵巢中有生殖细胞的增殖和卵泡更新。在用白消安处理后的不孕小鼠卵巢中，仍发现具有非闭锁卵母细胞的健康卵泡，并有显示排卵的黄体存在，这进一步说明存在能补充卵泡数的增殖性生殖细胞。同时发现在幼鼠及成鼠卵巢中具有表达减数分裂联合复合物蛋白3 的细胞。将野生型小鼠的卵巢组织移植到表达绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein，GFP)的雌性转基因小鼠卵巢后，发现移植的卵巢中产生了能表达GFP 的卵母细胞。因此，通过这一系列实验，他们认为出生后的小鼠卵巢中有GSCs，而且位于卵巢表面大的、呈卵圆形的生殖细胞有可能是GSCs。

2005年，Bukovsky 等［3］证实新的原始卵泡出现在卵巢表面上皮(OSE)内，由卵原细胞和原始颗粒细胞聚集形成。该研究取成人卵巢表面上皮细胞在雌激素刺激物酚红(PHR)存在的培养基内培养后观察发现，这些细胞直接分化为大的具有卵母细胞表型的细胞，可出现胚泡破裂并排出极体，表达透明带蛋白，即具有次级卵泡的特征。而不含有PHR 的培养基内，分化成颗粒型细胞。这表明OSE 可能是卵母细胞和颗粒细胞潜在的来源。尽管与功能性的卵母细胞产生仍有一定距离，但是这个发现给生殖干细胞的存在提供了间接证据。也有人提出生殖干细胞的来源还有可能是骨髓及外周血。Johnson等［4］将骨髓移植至经环磷酰胺和白消安处理后丧失了生殖细胞的小鼠体内，发现接受了骨髓移植的小鼠卵巢中有卵泡生成，而对照组小鼠卵巢中则没有或很少有卵泡生成。此外，将取自能表达GFP 转基因雌性小鼠的外周血移植至经过相同处理的小鼠体内，在卵巢中发现了表达GFP 的卵母细胞。因此，他们认为出生后的小鼠卵巢中存在卵母细胞和卵泡的更新。其来源可能是骨髓及外周血。尽管骨髓和外周血来源的细胞表现出了许多卵母细胞的特性，但是仍然不能够明确是否这些卵母细胞能够正常受精并发展成新的个体。

2 哺乳动物卵巢生殖干细胞存在的异议

尽管大量的实验数据支持哺乳动物出生后存在卵泡更新，但并未得到女性生殖干细胞存在的确切证据。同时，对于上述卵巢生殖干细胞的质疑也不断出现。2006年，Eggan 等［5］针对Johnson 成年哺乳动物骨髓和外周血能导致新的卵母细胞形成的结论，将表达GFP 的转基因小鼠与野生型正常小鼠配对形成嵌合体小鼠。进行嵌合的两只小鼠共用一套循环系统。按照预期，在野生型小鼠卵巢内应有GFP 标记的生殖细胞，在转基因小鼠内应有不表达GFP 的卵母细胞。然而，对嵌合体小鼠促排卵后获得的卵母细胞分析发现，来自转基因小鼠的卵母细胞都只表达GFP，而来自野生型小鼠的卵母细胞没有表达GFP。然后，将该种嵌合体小鼠中的野生型小鼠用环磷酰胺和白消安进行不孕处理，之后收集到的卵母细胞也没有GFP 阳性的表达。而在骨髓移植实验中，移植的骨髓细胞也未能改善绝经或化疗导致的不育情况。因此，他们认为成年动物的卵母细胞数目是固定的，也不能由循环的生殖干细胞更新生成。Eggan 等的研究结论也得到了一些学者的支持。2008年，Begum S 等［6］通过小鼠卵巢的移植实验，将成年小鼠的卵巢移植到荧光免疫标记的宿主动物的肾包膜或卵巢囊中，没有发现表达绿色荧光的卵母细胞生成，卵泡的数量也没有明显增长。因此没有证据表明有卵巢外的祖细胞植入卵巢内，也没有卵母细胞再生，因此他们与传统观点保持一致。但他同时认为也不能排除成年小鼠卵巢中存在生殖干细胞的可能性。

Liu 等［7］通过对成年女性的卵巢中的生殖细胞进行增殖和减数分裂的标记基因(SCP3)表达进行分析，结果认为不存在生殖细胞的更新或卵母细胞的生成，也没有生殖干细胞的存在。

3 小鼠生殖干细胞的分离纯化及后代的产生

当人们对卵巢中生殖干细胞的存在及来源仍存在争议的时候，国内外的很多研究者已经能够从成年小鼠卵巢内分离出罕见的具有有丝分裂活性的干细胞，并且在体外增殖培养数月后移植到不孕小鼠卵巢内，但是这些细胞的功能及受精能力还没有被确定［8-9］。2009年又有了新进展，研究者从新生和成年小鼠卵巢中分离并建立了同时具有生殖细胞性和干细胞性，并且可以长期体外培养的生殖干细胞系［10］。该细胞系具有正常的核型及较高的端粒酶活性。该研究者通过酶消化及磁性分选法将小鼠卵巢中表达MVH(干细胞特殊性蛋白)的细胞分离出来，在掺入BrdU 的培养基中进行培养。由于出生后小鼠卵巢中生殖细胞是不再进行有丝分裂增殖的。BrdU 阳性表示细胞正在增殖，MVH 阳性表明该细胞属于生殖干细胞，认为MVH 和BrdU 都呈现阳性的细胞有可能是雌性GSCs。他们将这些呈现双阳性的细胞从成年小鼠内分离出来并建立细胞系，经过多次传代培养后仍为双阳性。这些GSCs被GFP 标记后移植到经白消安处理后的不孕小鼠的卵巢中，发现转移的细胞能够产生卵子，并且能够产生携带GFP 基因的后代。这一结果的发现，为卵子的产生及干细胞的自我更新做出了贡献。该研究组报道发现了卵巢中生殖干细胞的存在，这些细胞具有相似于精原干细胞的一般特征，且定位于卵巢表面上皮层。2011年，该研究组又称上次报道的MVH 磁珠分选和纯化雌性GSCs 的效率低下，而通过采用生殖性特异表达蛋白Fragilis 进行磁珠分选能大大提高雌性GSCs 纯化的效率［11］。该研究组分离纯化的细胞在未分化的状态下表达干细胞多能性及生殖细胞的标志物，例如碱性磷酸酶(AKP)、Oct4、Sox - 2 和SSEA - 1［12］。亦 有 研 究 者 从 果蝇［13］及青鳉鱼［14］体内证实了生殖干细胞的存在。

4 人类卵巢生殖干细胞的研究

目前人们已经能从小鼠的卵巢中成功分离出雌性生殖干细胞并移植到不孕小鼠卵巢内成功培育出了下一代。然而在人类的卵巢中是否也存在这样的细胞并且也能够通过移植产生新个体呢?2012年2月White 等［15］成功地从20 ～30 岁年轻女性的卵巢上皮组织中分离出卵母干细胞(oogonial stem cells，OSCs)。另外他们确定了一种敏感的分离方法:荧光激活细胞分类法(FACS)。这种方法的应用可以从小鼠和人类卵巢中分离出罕见具有有丝分裂活性的细胞，与原始干细胞具有相似的基因表达。这种方法在体外的建立，可以成功分离生殖干细胞并在体外培养并扩增，自发地产生35 ～59 μm 的卵母细胞，并通过所产生卵母细胞的细胞形态、基因表达及单倍体状态所鉴定。稳定表达GFP 的生殖干细胞，被注入到生殖期女性的离体卵巢皮质组织中，并将其移植到小鼠的卵巢中，发现在人类卵巢组织中产生了GFP 阳性的卵泡，因此年轻女性的卵巢类似于成年小鼠，具有产生有丝分裂活性的干细胞，能够在体外繁殖并在体外和体内产生卵母细胞。应用这种异基因移植法的小鼠的卵巢组织虽然与正常人类生理环境不相同，但是由于伦理的限制，这仍是很多学者用于研究新生卵泡的较好的方法。该研究结果的发表立即引起广泛的争议。人们能达成共识的是成年哺乳动物卵巢中OSCs 的生物学角色和OSCs 自我更新和分化成卵母细胞的控制能力。

然而，既然体内激活的卵母干细胞能够更新卵泡池，为什么他们不能随着年龄的增长维持卵巢功能［16］?事实上，卵巢老化是很多科学家在研究OSCs 和出生后卵子形成最重要的障碍，有研究者已经发现无卵子产生和绝经后女性卵巢中OSE 干细胞具有体外分化成卵母细胞的能力［17］。然而，有研究表明35 ～40 岁女性，免疫系统的功能在逐渐下降，并伴随着卵巢卵泡更新的下降［18］。Bukovsky 称人类正常卵巢内的生殖干细胞的生卵活性与两个条件有关:第一，在女性妊娠期或排卵前期，激素的水平应该达到一定的条件，例如雌激素和LH/hCG 的循环高水平。然而，在满足激素条件下，只有一部分卵母干细胞分化成了生殖细胞，这是因为没有免疫系统相关细胞的细胞信号通路的存在［19-20］，即哺乳动物卵巢的免疫生理学［21］或卵巢内稳态的免疫调节［22］。通过对免疫系统相关细胞(T 细胞及单核细胞来源细胞MDC)的免疫组织化学分析，卵母干细胞分化成生殖细胞需要原始MDC 和活化的CD8+T细胞的参与，颗粒细胞的出现同样需要活化的(HLA-DR)MDC［19，21］。然而，卵巢OSE 干细胞在体外产生卵子不需要这些免疫系统相关细胞参与。因此，只有当合适的激素水平及免疫系统相关细胞活化的局部细胞信号同时出现时才能使OSCs 向生殖细胞分化。这些新发现的细胞与卵巢老化过程的相关性还需要更多的探讨。

White 将从人类卵巢组织中分离出的卵母干细胞在体外培养基内培养，发现只能产生初级卵母细胞，没有发现减数分裂二期的卵母细胞产生。这是由于体外培养与人体自体卵巢组织的微环境的差别。没有某些活化物质的存在。而将卵母干细胞移植到人类卵巢组织中去培养可以诱导产生原始卵泡、初级卵泡、窦前卵泡、窦状卵泡等。如果能够进一步分化成减数分裂二期的卵子，将对未来的染色体的完整性，纺锤体的出现及发展能力都会有更大的帮助［15］。在未来的研究中，将试图进一步改进体外培养基，使它可以更好的模拟正常人体卵巢内环境。可以更好的分化出有生殖能力的卵子，并期待能够产生新的个体。

5 人类OSCs 未来的临床应用

对于人类OCSs 的基础研究和临床应用还有许多尚待探索和开发的内容，如果通过OCSs 的培养能够成功分化出有生殖能力的卵子，那么将在未来产生多方面的临床应用:首先，人们可以进行体外分离及培养OSCs，评估其在体外产生卵子的潜能［15］，并可以通过实验系统揭示体外卵子产生中关键的信号通路。将激素及其他影响因素作用于OSCs 来观察生卵能力，通过对影响因素的鉴定可以找到一种方法提高OSCs 生卵的活性。其次，有研究表明，将年轻女性的卵质移植到反复IVF 失败的患者的卵泡内将提高其IVF 的成功率，但这种方法将使新生的个体中包含两种不同来源的线粒体，携带两种基因［23-24］，为了解决这个难题，人们设想出一个新的技术，名为“自体生殖细胞线粒体能量传递(AUGMENT)［25］”，它是将女性卵巢内OSCs 自然产生的能量注入到同一个体卵子中以提高IVF 的成功率。这种自体OCS 来源的线粒体移植到ICSI 的人类卵母细胞的方法克服了现存线粒体因为老化及其他因素引起的负面影响。Cohen J 等［26］的研究已经证实异体线粒体的移植可以提高IVF 的成功率，因此AUGMENT 应该成为临床上可考虑的方法，这仍需要更多的研究来支持。另外，OCSs 还有很多值得期待的应用，例如，这些OCSs 将被冷冻保存以利于未来应用于不孕、恶性肿瘤、干细胞基因移植等多种方面。分离纯化后的人类OCSs 还可以作用于自身卵巢，提高体内卵巢的储备功能的规模。尽管最近的研究已经证实异基因移植的方法可以使人类卵母细胞形成，但是任何的临床应用还需要更确切的依据的提出，这些OSCs 可能的临床应用虽然只是畅想，但未来经过我们更多更全面的研究和探索，这些临床价值终将呈现。

6 小 结

在对哺乳动物卵巢出生后是否存在生殖干细胞这个问题的大量研究中，许多干细胞实验被誉为重大突破。相关发现已经在小鼠中报道，目前更重要的是人类中的新发现。尽管在临床应用上还有许多难以操作和理论上的障碍，能够确定的是，这个工作有很大的潜力去改变不孕症治疗的未来。提高OSCs 的分离和转变成卵母细胞的效率还需要更多的研究。更多的基因完整性和卵母细胞质量标记物还需要更多详细的描述。但相信由于该研究所具有的重大意义，新的进展必将会不断出现。

［1］ Mandl AM，Zuckerman S. The relation of age to numbers of oocytes［J］. J Endocrinol，1951，7:190 -193.

［2］ Johnson J，Canning J，Kaneko T，et al. Germline stem cells and follicular renewal in the postnatal mammalian ovary［J］. Nature，2004，428:145 -150.

［3］ Bukovsky A，Svetlikova M，Caudle MR. Oogenesis in cultures derived from adult human ovaries［J］. Reprod Biol Endocrinol，2005，3:17.

［4］ Johnson J，Bagley J，Skaznik - Wikiel M，et al. Oocyte generation in adult mammalian ovaries by putative germ cells in bone marrow and peripheral blood［J］. Cell，2005，122:303 -315.

［5］ Eggan K，Jurga S，Gosden R，et al. Ovulated oocytes in adult mice derive from non-circulating germ cells［J］. Nature，2006，441:1109 -1114.

［6］ Begum S，Papaioannou VE，Gosden RG. The oocyte population is not renewed in transplanted or irradiated adult ovaries［J］. Hum Reprod，2008，23:2326 -2330.

［7］ Liu Y，Wu C，Lyu Q，et al. Germline stem cells and neo-oogenesis in the adult human ovary［J］. Dev Biol，2007，306:112 -120.

［8］ Wang N，Tilly JL. Epigenetic status determines germ cell meiotic commitment in embryonic and postnatal mammalian gonads［J］. Cell Cycle，2010，9:339 -349.

［9］ Pacchiarotti J，Maki C，Ramos T，et al. Differentiation potential of germ line stem cells derived from the postnatal mouse ovary［J］. Differentiation，2010，79:159 -170.

［10］ Zou K，Hou L，Sun K，et al. Improved efficiency of female germline stem cell purification using fragilis -based magnetic bead sorting［J］. Stem Cells Dev，2011，20:2197 -2204.

［11］ Zou K，Yuan Z，Yang Z，et al.Production of offspring from a germline stem cell line derived from neonatal ovaries［J］.Nature Cell Biology，2009，11(5):631 -636.

［12］ Kakegawa R，Teramura T，Takehara T，et al. Isolation and culture of rabbit primordial germ cells［J］. J Reprod Dev，2008，54:352 -357.

［13］ Zhao R，Xuan Y，Li X，et al. Age -related changes of germline stem cell activity，niche signaling activity and egg production in Drosophila［J］. Aging Cell，2008，7:344 -354.

［14］ Nakamura S，Kobayashi K，Nishimura T，et al. Ovarian germline stem cells in the teleost fish，medaka (Oryzias latipes)［J］. Int J Biol Sci，2011，7:403 -409.

［15］ White YA，Woods DC，Takai Y，et al. Oocyte formation by mitotically active germ cells purified from ovaries of reproductive-age women［J］. Nat Med，2012，18:413 -421.

［16］ Tilly JL，Telfer EE.Purification of germline stem cells from adult mammalian ovaries:a step closer towards control of the female biological clock［J］. Mol Hum Reprod，2009，15:393 -398.

［17］ Bukovsky A，Virant-Klun I，Svetlikova M，et al. Ovarian germ cells［J］. Methods Enzymol，2006，419:208 -258.

［18］ Mathe G. Immunity aging. I. The chronic perduration of the thymus acute involution at puberty?Or the participation of the lymphoid organs and cells in fatal physiologic decline?［J］.Biomed Pharmacother，1997，51:49 -57.

［19］ Bukovsky A.Immune system involvement in the regulation of ovarian function and augmentation of cacer［J］. Microc Res Tech，2005，69:482 -500.

［20］ Bukovsky A.Cell commitment by asymmetric division and immune system involvement［J］. Prog Mol Subcell Biol，2006，45:179 -204.

［21］ Bukovsky A，Caudle.Immunephysiology of the mammalian ovary［J］.Am J Reprod Immunol，2008，59:12 -26.

［22］ Bukovsky A，Gupta SK. Immunoregulation of ovarian homeostasis in novel concepts in ovarian endocrinology［J］.Gonzalez-Bulnes A，2008:131 -168.

［23］ Brenner CA，Barritt JA，Willadsen S，et al. Mitochondrial DNA heteroplasmy after human ooplasmic transplantation［J］. Fertil Steril，2000，74:573 -578.

［24］ Barritt JA，Brenner CA，Malter HE，et al. Mitochondria in human offspring derived from ooplasmic transplantation［J］. Hum Reprod，2001，16:513 -516.

［25］ Zhang Y，Yang Z，Yang Y，et al. Production of transgenic mice by random recombination of targeted genes in female germline stem cells［J］. J Mol Cell Biol，2011，3:132 -141.

［26］ Cohen J，Scott R，Alikani M，et al. Ooplasmic transfer in mature human oocytes［J］. Mol Hum Reprod，1998，4:269 -280.