“红花末”色素理化特性及安全性分析

王忠合，王 军，江晓东，蔡秋儿

（韩山师范学院 生物系，广东 潮州 521041）

化学合成色素最早出现于十八世纪中期，由于食用合成色素的安全问题，各国实际使用的品种数逐渐减少，其余尚可使用的种类、用量及使用范围也都受到了严格的限制.近年来，人们已将目光转向了天然色素，虽然在色素含量和稳定性等方面不如化学合成品，但因其大多来自水果、蔬菜等资源，对人体的安全性较高.此外，很多天然色素易于吸收，本身又兼具保健功能，对于癌症、心脏病、眼科疾病等具有较好的预防效果[1-4].

“红花末”色素，又称为“胭米”红色素，是潮汕制作红桃粿等潮汕小吃时常用的一种色素[5,6]，在潮汕风俗小吃中“红花末”色素普遍使用，潮汕人为了追求吉祥，在一些米粿上涂一点“红花末”色素，所以“红花末”色素在潮汕地区的民俗文化和小吃中处在一个举足轻重的位置.由于在传统方法制作中使用的“红花末”色素应用历史久远，且多为民间生产，无法考证其具体来源，相关的研究文献也非常少，其所含化学成份尚未阐明，但是因其色泽鲜艳、性质稳定、着色力强、成本低廉，在糕点上彩装领域应用范围非常广，机体摄入后对人体健康的影响也未知，因此关于其安全性研究就十分必要.

本实验首先分析该色素的理化特性，再依据我国食品安全性毒理学评价程序和方法（GB 15193-2003）的规定[7]，进行第一阶段的急性毒性试验和第二阶段的遗传毒性试验，以评价“红花末”色素的安全性，旨在为该色素的应用提供一定的参考依据.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

“红花末”色素，购于当地市场.秋水仙素、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、吉姆萨染料、甘油、甲醇、冰醋酸、伊红、氯化钠，琼脂、牛肉膏、蛋白胨等均为分析纯.

1.2 仪器与设备

TU-1901紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）；X52-H显微镜配照相系统（北京泰克仪器有限公司）；AUW120型电子天平（SHIMADZU（日本）公司）等.

1.3 实验方法

1.3.1 图谱扫描

配制0.02mg/mL的色素水溶液，扫描200～800 nm的吸收图谱，确定色素溶液的特征吸收峰.

1.3.2 色素稳定性试验

（1）温度对色素稳定性的影响

在每支具塞试管中称取0.5mg色素，用蒸馏水定容至25mL，分别在34、54、74℃下保温，每隔90min取样，冷却至25℃，测定色素溶液的吸光度，比较温度对色素稳定性的影响.

（2）光照对色素稳定性的影响

在每支具塞试管中称取0.5mg色素，蒸馏水定容至25mL，分别置于暗处、日光灯下、紫外灯下，每隔60min取样，冷却至25℃，测量色素溶液的吸光度，比较光照对色素稳定性的影响.

1.3.3 色素毒理学检测

（1）急性毒性试验

采用寇氏法[7，8]测定色素对小鼠的LD50值，取体重18～20 g的健康Wistar小鼠30只，随机分为5组，雌雄各半.小鼠隔夜空腹，禁食16 h，不限制饮水，实验组采用6个对数等距的剂量，每只按0.4mL/20 g体重灌胃，空白组给水对照.观察2周，记录小鼠死亡情况，计算LD50值.

（2）小鼠精子畸变试验

选择性成熟的雄小鼠25只（体重25～30 g），随机分为5组，每组5只，试验组以1/8、1/4、1/2 LD50值为低、中、高剂量组，同时设阴性对照组（蒸馏水）和阳性对照组（秋水仙素0.4mg/kg·bw，腹腔注射1次）.每天灌胃1次，连续灌胃5 d，各组均于第一次给予受试物后第21 d用颈椎脱臼法处死动物，取出两侧附睾，放入盛有适量生理盐水的小烧杯中，用眼科剪将附睾纵向剪两刀，静置3～5min，轻轻摇动.用四层擦镜纸过滤，吸滤液涂片，于空气中干燥后，用甲醇固定5min以上干燥.用1%～2%伊红染色1 h，用水轻冲，干燥后在低倍镜下（用绿色滤光片）找背景清晰、精子重叠较少的部位，用高倍镜检查精子形态，计数结构完整的精子.精子有头无尾（轮廓不清）或头部与其他精子或碎片重叠，或明显是人为剪碎者，均不计算.每只小鼠计数1 000个精子，记录畸变精子数，计算畸变率.

1.3.4 实验数据处理

实验数据以平均值±标准偏差SD表示，采用SPSS 20.0统计软件分析其差异性.

2 结果与分析

2.1 图谱扫描结果

“红花末”色素水溶液吸收光谱如图1所示.

图 1 色素水溶液的吸收光谱图

由图1可知，“红花末”色素溶液在200～800 nm之间有5个吸收峰，分别在230、260、270、360、560 nm处，可见区的特征吸收峰为560 nm，其成分及其化学结构还有待于进一步研究.在接下来的稳定性试验中测定吸光度的波长选定560 nm.

2.2 稳定性试验

分别考察温度和光照对色素稳定性的影响，色素残存率随时间变化的实验结果如图2所示.从图2（a）可以看出，该色素的热稳定性较好，可耐受长时间的加热处理.随着加热温度的升高，该色素的最大降解率小于2%，这也与该色素用于糕点上彩装时在蒸制过程中仍能保持较好的色泽结果一致.因此，在实验范围内，温度对色素稳定性的影响不明显（p＞0.05）.从图2（b）可以看出，在不同的光照情况下，光照对色素的稳定性的影响不明显，但在处理2 h后，光照对色素的稳定性的影响差异较大，紫外光对色素的破坏作用最大，这可能与色素对紫外光敏感有关.

图 2 色素的热稳定性（a）和光稳定性（b）

2.3 急性毒性试验

小鼠灌胃后，耳朵、尾巴、眼眶、爪子立即变红，3 h后排出的粪便呈红色，如图3所示；剂量大于1 000mg/kg·bw的实验组小鼠灌胃4 h后出现眼球外凸、反应迟钝、静呆在角落里，5 h后出现打滚挣扎的现象，6.5 h后死亡；48 h剩余小鼠身上仍有较浅的红色、粪便也呈较浅的红色.死亡的小鼠解剖发现肝脏为黑色，表面有些地方是粉色，而心脏、胃、肠等都是红色，胃和食道没有出现穿孔的现象，由此确定小鼠是由于色素中毒死亡的，而非灌胃操作不当引起的.根据初步实验结果和国家急性毒性实验方法，采用10～3 162mg/kg·bw的剂量灌胃，按照寇氏法计算，“红花末”色素LD50值为1 259mg/kg·bw，参照国家急性毒性剂量分级，可以认为该色素属于低毒级，在实际应用时应当严格限制其用量.

图 3 小鼠灌胃后变红的部位（a）及其排泄物（b）

2.4 小鼠精子畸变试验

小鼠精子畸变试验结果如表1所示.由结果可知，“红花末”色素诱导小鼠精子畸变率试验中，三种剂量组和阳性对照组间对小鼠精子畸变率与阴性对照组之间有显著差异（p＜0.05），畸变精子中无定形、尾折叠、双尾、香蕉形、无钩、双头等畸变精子如图4所示.小鼠精子畸变试验所反映的遗传学终点主要是对生殖细胞的遗传毒性进行评估，而且精子畸变率升高从本质上也能代表一定的生殖毒理学意义[8-10].遗传毒性试验结果表明，“红花末”色素在试验剂量范围内，对小鼠精子有明显的致突变作用，所以在使用中需严格限制其用量，或者使用食用天然色素代替，有关其遗传毒性试验还需进一步研究证实.

表1 色素对小鼠精子畸变率的影响

图 4 畸变精子图

3 结论

（1）“红花末”色素在200～800 nm波长范围内有五个吸收峰，分别为230、260、270、360、560 nm，在可见区的特征吸收峰是560 nm处，色素光稳定性较差，热稳定性较好.

（2）急性毒性试验表明，“红花末”色素半数致死量（LD50）值为：1 259mg/kg·bw，属于低毒级.小鼠精子畸变试验结果表明该色素具有一定的致突变性，使用中应注意其用量.

（3）“红花末”色素虽然其应用历史久远，但其安全性研究报道较少，本研究发现在试验剂量范围内，“红花末”色素对小鼠精子的畸变率较高，长期食用会对人类的生殖系统产生一定的影响，关于其安全性需深入研究.

[1]高彦祥，许正虹.食用天然色素安全性研究进展[J].食品科学，2005，26（5）：158-160.

[2]史海英，吕晓玲.紫玉米色素的稳定性研究[J].现代食品科技，2007，23（11）：7-10.

[3]SANJAY K,KUMARESANN,AKHILENDERNAIDU K,etal.Safety evaluation of pigmentcontaining Aspergillus carbonarius biomass in albino rats[J].Food and Chemical Toxicology，2007，45（3）：431-439.

[4]MICHAELMCCLAINR,BAUSCH J.Summary of safety studies conducted with synthetic lycopene[J].Regulatory Toxicology and Pharmacology，2003，37（2）：274-285.

[5]詹应炫.潮汕小吃掠影[J].中国食品，1992，2（2）：29-30.

[6]胡朝举，庄东红，高雪，等.潮汕小吃市场拓展路径之连锁经营分析[J].韩山师范学院学报，2012，33（1）：40-44.

[7]中华人民共和国卫生部.GB 15193.1-2003食品安全性毒理学评价程序[S].北京：中国国家标准化管理委员会，2003.

[8]郑建仙.功能性食品（第三卷）[M].北京：中国轻工业出版社，2005.

[9]李进，原惠，曾献春，等.黑果枸杞色素的毒理学研究[J].食品科学，2007，28（7）：470-475.

[10]HOOTH M J,SILLSR C,BURKA L T,etal.Toxicology and carcinogenes is studies of microencapsulated trans-cinnamaldehyde in rats and mice[J].Food and Chemical Toxicology，2004，42（11）：1757-1768.