等离子体降解黄曲霉毒素B1的试验研究

张 岩 董晓娜 姜文利 王世清

（青岛农业大学食品科学与工程学院1，青岛 266109）

（青岛市现代农业质量与安全工程重点实验室2，青岛 266109）

黄曲霉毒素（Aflatoxins，简称AFT）具有极强的致癌性、致畸性和致突变性，在1993年即被WHO国际肿瘤研究机构划定为Ⅰ类致癌物［1－2］。据FAO统计，世界上约有25%的粮食产品受到真菌毒素的污染，其中黄曲霉毒素是污染最严重的真菌毒素之一［3］。大豆、谷物、玉米、花生、调味品、奶制品、食用油等农产品中经常发现黄曲霉毒素，其中花生和玉米黄曲霉毒素污染最严重［4］。目前降解黄曲霉毒素常用的方法主要有二氧化氯浸泡法、生物法、辐照法等［5－10］，但化学法极易带来新的有机溶剂残留，生物法则由于成本和技术原因难以推广，因此，本实验拟研究一种基于物理处理——等离子体处理的新方法以替代传统的化学、生物法。

等离子体技术自20世纪80年代已广泛应用于医学、军事等领域［11－15］，Yamatake等［16］利用脉冲电晕放电处理含酚水溶液，在FeSO4存在条件下，1～2.4 mg／L苯酚溶液15 min后全部降解；Tezuka等［17］研究了等离子体降解水溶液中的苯酚、苯甲酸和氯苯，发现降解是由于等离子体和阳极液体界面产生OH自由基引起的；陈根生［18］等降解废水中4－氯酚，证实其降解主要是放电产生氢氧自由基的结果；Patel等［19］发现同时使用过氧化氢和伽玛射线照射可以更有效地降低AFT的毒性，4 kGy伽玛射线和5%的过氧化氢可使100 pgAFT完全灭活。

等离子体技术应用领域虽然广泛，但将其用于黄曲霉毒素降解的研究报道较少。为了考察和评价等离子体处理对黄曲霉毒素降解的影响效果，本文选用黄曲霉毒素B1为试验材料，利用响应面分析法优化等离子体降解黄曲霉毒素的参数，以期为等离子体处理黄曲霉毒素的深入研究提供试验依据。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

黄曲霉毒素B1（Clenbuterol）ELISA检测试剂盒（96孔）：杭州天迈生物科技有限公司。

等离子发生器：美国Dressler公司生产；酶标仪：上海坤肯生物化工有限公司。

1.2 试验装置

试验装置由青岛农业大学食品科学与工程学院自行设计研制，该装置主要由射频等离子发生器1、水冷却器2、等离子发生仓4和真空泵8等组成，如图1所示。等离子体发生仓4内设有等离子体电极3，工作时，将试验物料7放入处理仓两极之间，利用真空泵8将整个系统置于高真空状态下，通过调节等离子发射器功率、两极间距，控制作用时间等参数可对该设备的降解效果和机理进行系统的研究。

图1 试验装置图

1.3 试验方法

选取对黄曲霉毒素B1降解有影响的3个主要因素：作用功率、作用时间和极距，根据 Box－Benhnken试验设计原理，采用3因素3水平响应面分析方法进行试验设计，以降解率为响应值（Y），进行影响因素的工艺优化试验。

1.4 测试方法

样品中黄曲霉毒素含量用黄曲霉毒素ELISA检测试剂盒和酶标仪进行测定。本试验使用的黄曲霉毒素B1ELISA试剂盒参考国家标准GB／T 5009.22—2003，能够快速而准确的分析样品中黄曲霉毒素B1残留，且本试剂盒已广泛应用于企业快速检测，故使用此检测方法较可靠。

1.4.1 溶液配制

洗涤工作液：用去离子水将浓缩洗涤液按1∶9体积比进行稀释，用于酶标板的洗涤。

6个不同浓度的标准液：样品取6个1.5 mL离心管，从1到6进行编号。取6个浓度的标准品50 μL分别加入以上6个管中，然后每管加入450μL去离子水进行 1∶9倍稀释，制备成 0、0.1、0.3、0.9、2.7、8.1μg／kg的标准液。此系列溶液为毒素标准品系列溶液，由于标准品数量有限，配置浓度较低。试验样品先经稀释再进行检测，使样品检测值在标准曲线的线性范围之内，样品实际质量浓度高于20 μg／kg。

1.4.2 测试步骤

将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温（20～25℃）平衡30 min以上，每种液体试剂使用前均摇匀。

取出需要数量的微孔板，将暂时不用的微孔板放进原锡箔袋中并且与提供的干燥剂一起重新密封，保存于2～8℃。

将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在位置。

将处理后的样品稀释至5 mL，用移液枪取50 μL到对应的微孔中，再加入酶标物50μL／孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置室温避光环境中反应15 min。

揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液30 μL／孔，充分洗涤5次，每次间隔30 s，用吸水纸拍干。

加入显色液100μL／孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置室温避光环境反应15 min。

加入终止液50μL／孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450 nm处测定每孔OD值。

1.4.3 标准曲线绘制与计算

以标准品百分吸光率为纵坐标，以黄曲霉毒素B1标准品浓度的对数为横坐标，绘制标准曲线图。在0.1～8.1μg／kg范围内，标准曲线拟合良好，其线性方程为：

Y＝－38.904x＋41.162，R2＝0.967 8

1.4.4 黄曲霉毒素B1降解率

本试验结果以黄曲霉毒素B1降解率为评价指标，公式如下：

2 结果与分析

表1和表2分别为等离子体降解黄曲霉毒素影响因素的优化试验结果及回归分析。

表1 响应面试验设计及数据处理

采用SAS RSREG程序对响应值与各因素进行回归拟合后，得到以下回归方程：

由表2可以看出，各因素中一次项X1、X2、二次项X12、X22是极显著的，其次是一次项X3是显著的，各试验因素对响应值的影响不是简单的线性关系，对黄曲霉毒素B1降解效果的影响顺序（强→弱）：X1＞X2＞X3。由表2也可以看出，失拟检验不显著，说明所建立的回归方程拟合很好，试验误差不含其他不可忽略的因子对试验结果影响。

表2 回归分析结果

采用Design－Expert 7.0软件对数据进行处理，考虑了因素间的交互效应关系，可得图2～图4。由图2～图4可知，作用功率对黄曲霉毒素B1降解率的影响最为显著，表现为曲线较陡；作用时间次之，相

图2 Z＝f（X1，X2）的响应面与等值线

应表现为曲线较为平缓；极距随其数值的增加或减少，黄曲霉毒素B1降解率没有显著性变化。

图3 Z＝f（X2，X3）的响应面与等值线

图4 Z＝f（X1，X3）的响应面与等值线

将式（1）分别对各自变量（X1、X2和X3）求偏导数并均令其为0，即可得到一个三元一次线性方程组，通过解此线性方程组得到最大黄曲霉毒素B1降解率和对应的极值点。预测最佳点为：X1＝200，X2＝77.8，X3＝2.51；代入回归方程，得最佳产物得率Y＝52.03%。因此，模型预报的最佳参数为作用功率200 W、作用时间77.8 s、极距2.51 cm。但考虑到实际操作的便利，将等离子体的最佳条件工艺修正为作用功率200 W、作用时间80 s、极距3 cm。按照此工艺条件降解黄曲霉毒素B1，实际降解率可达51.67%，与预测值基本一致（相对误差0.69%），表明该方程与实际情况拟合得较好，充分验证了所建模型的正确性。

3 结论

3.1 等离子体对黄曲霉毒素B1有显著的降解效果，降解效果与等离子体作用功率、作用时间、极距等因素有关，影响顺序为作用功率＞作用时间＞极距。

3.2 本试验范围内，等离子体处理黄曲霉毒素B1的最佳工艺条件为作用功率200 W、作用时间80 s、极距3 cm，降解率可达51.67%。

3.3 等离子体处理简单快速、无化学污染、低能耗易管理，很容易实现与现有的农产品生产线耦合链接，其产业化应用前景十分广阔。

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