Beclin1和Atg5在上皮性卵巢癌组织中的表达及临床意义

邓琦程，王福萍，高爱华，朱维培，史 明，钱志红，张 弘

(苏州大学附属第二医院妇产科，江苏苏州215004)

卵巢恶性肿瘤是女性生殖系统3 大恶性肿瘤之一，发病率较高，仅次于宫颈癌和子宫内膜癌，但由于其起病较为隐匿，早期诊断困难，故卵巢癌临床确诊时70%已属晚期。卵巢癌术后易复发，且易出现腹盆腔及淋巴结转移，其病死率居妇科恶性肿瘤之首［1］。其发病机制尚未完全明确，近期有研究发现其发生发展与自噬活性的改变有关［2］。自噬相关基因Beclin1 和Atg5 是参与自噬调控的重要基因，本研究采用免疫组化和RT-PCR 检测其在不同卵巢组织中的表达情况，探讨Beclin1 和Atg5 在卵巢癌发生发展中的作用。

1 材料与方法

1.1 标本采集

采用苏州大学附属第二医院2011—2012年手术标本，共90 例，其中正常卵巢组织、良性卵巢肿瘤、上皮性卵巢癌各30 例。正常卵巢组织来源于畸胎瘤手术中畸胎瘤旁正常卵巢上皮、子宫肌瘤行子宫及附件切除者的卵巢，恶性性卵巢癌组织中浆液性15 例，黏液性9 例;淋巴转移6 例;按国际妇产科联盟(FIGO 2000)临床分期及病理分级标准，Ⅰ期3例，Ⅱ期5 例，Ⅲ期17 例，Ⅳ期5 例;组织学分级:G1期10 例，G2 期15 例，G3 期5 例。标本经病理学证实，均未接受术前放疗、化疗。

1.2 主要试剂

免疫组化主要试剂:Beclin1 和Atg5 兔抗单克隆抗体(EPITMICS 公司);过氧化物酶标记的链霉素试剂盒和二氨基联苯胺(diaminobenzidine，DAB)试剂盒(上海基因公司)。RT-PCR 主要试剂:反转录试剂盒(Fermentas 公司);PCR 引物(由Invitrogen 公司合成)。

1.3 方法

1.3.1 免疫组化染色检测与阳性结果判定:采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法(streptavidinperosidase，SP)，按试剂盒要求进行操作。石蜡切片常规脱蜡水化，对抗原采用高压热修复，依次滴加过氧化物酶阻断剂(37 ℃避光孵育15 min)，第一抗体(室温孵育30 min)，生物素标志的第二抗体(室温孵育30 min)，DAB 显色，苏木精复染，脱水，透明，封片。以PBS 代替一抗作阴性对照。阳性结果判定:胞质内出现棕黄色颗粒为阳性。综合切片中细胞的染色强度和阳性细胞计数进行半定量分析。判断标准为:背景清晰无色为阴性(－ )，阳性细胞＜25%为弱阳性(+ )，25% ～75% 为阳性(++)，＞75%为强阳性(+ + +)，弱阳性及阳性为低表达，强阳性为高表达。每张切片至少观察5个高倍镜视野。

1.3.2 RT-PCR:1)组织RNA 的提取:每份冻存标本取1 mm3剪碎研磨，加入1 mL Trizol(总RNA 提取试剂)溶液裂解后经氯仿等提取细胞总RNA 以DNA/RNA 测定仪测定RNA 的纯度和浓度，调整mRNA 的浓度在1.8 ～2.0。2)cDNA 的合成按反录试剂盒说明合成。3)PCR 反应Beclin1 引物序列:5'-CAAGATCCTGGACCGTGTCA-3'(上游引物)，5'-GTGACGTTGAGCTGAGTGT-3'(下游引物)，目的片段为372 bp。Atg5 引物序列:5'-ATGACAGATGACA AAGATGTGC-3' (上游引物)，5'-TGTGCCTTCATA TTCAAACC-3'(下游引物)，目的片段为225 bp。以β-actin 作为内参照。反应体系为:2 × PCR Master-Mix 10 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA 模板1 μL，去离子水7 μL，总体积为20 μL。PCR 条件为:94 ℃30 s，55 ℃30 s，74 ℃30 s，共30 个循环。取PCR扩增产物在琼脂糖凝胶中电泳，电泳结果在凝胶成像分析系统进行扫描分析，以目的基因的扩增产物条带吸光度值与内参β-actin 扩增产物条带吸光度值的比值表示目的基因mRNA 的相对表达水平。

1.4 统计学分析

应用SPSS17.0 软件进行统计学处理，RT-PCR半定量数据采用t 检验，蛋白表达水平采用卡方检验。

2 结果

2.1 免疫组化检测结果

Beclin1 和Atg5 蛋白在不同卵巢组织中的表达情况:Beclin1 蛋白表达主要位于细胞质内，在正常卵巢组织、良性卵巢肿瘤、上皮性卵巢癌组织中的阳性率分别为83.3%、70%和36.7%，上皮性卵巢癌中Beclin1 蛋白的表达显著低于正常卵巢组织和良性卵巢肿瘤(P＜0.01)(图1)。Atg5 蛋白阳性表达主要位于细胞质，强阳性时，细胞系中也有表达。在正常卵巢组织和良性卵巢肿瘤中的阳性率分别为73.3%、60%，显著高于上皮性卵巢癌中的33.3%，与正常卵巢组织、良性卵巢肿瘤相比(P＜0.05)(图2)。

2.2 RT-PCR 检测结果

上皮性卵巢癌组织中Beclin1 和Atg5 的mRNA含量低于卵巢良性肿瘤组织和正常卵巢组织(P＜0.01)(表1，图3)。

表1 各组织中Atg5 与Beclin1 的mRNA 表达Table 1 Expressions of Atg5 and Beclin1 mRNA in different ovarian tissues(±s，n=30)

表1 各组织中Atg5 与Beclin1 的mRNA 表达Table 1 Expressions of Atg5 and Beclin1 mRNA in different ovarian tissues(±s，n=30)

#P＜0.01 compared with normal ovarian tissues group;*P＜0.01 compared with benign ovarian tumor tissues group．

groupBeclin1Atg5 normal ovarian tissues0.695 ±0.1220.624 ±0.145 benign ovarian tumor tissues 0.615 ±0.1190.523 ±0.133 ovarian cancer tissues0.243 ±0.104#*0.300 ±0.116#*

2.3 上皮性卵巢癌组织中Beclin1 与Atg5 蛋白的表达与临床病理学特征的关系

上皮性卵巢癌组织中Beclin1 与Atg5 蛋白表达及肿瘤的细胞分化程度、组织分期之间显著相关(P＜0.05)(表2)。

3 讨论

自噬是在自噬相关基因 (autophagy related gene，Atg)的调控下将细胞质中的大分子物质和一些内源性底物在单位膜包裹的自噬囊泡中降解的过程，在维持细胞代谢平衡及内环境的稳定方面至关重要［3］。自噬活性的改变将影响细胞的生长、增殖，与肿瘤的发生、发展关系密切。

图3 Atg5 和Beclin1 基因PCR 扩增结果Fig 3 PCR results of Atg5 and Beclin1 gene

表2 卵巢上皮性癌组织中Beclin1 与Atg5 的表达及临床病理学特征的联系Table 2 The potential relations between expressions of Beclin1 and Atg5 protein and clinical pathological features

Beclin1 基因(也称BECN1 基因)，是第一个被鉴定的自噬基因，由Aita 于1999年发现其位于人类染色体17q21 上，是酵母自噬基因atg6/vps30 的同源物［4］。Beclin1 可以通过提高细胞自噬抑制肿瘤的生长，是候选的肿瘤抑制基因，Beclin1/ hVps34 复合物参与自噬体形成的早期阶段，为前自噬体的形成招募其他ATG 蛋白［5］，是参与自噬调控的重要基因。研究表明乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌等多种肿瘤与Beclin1 基因功能的缺失相关［6］。本研究发现Beclin1 蛋白在上皮性卵巢癌组织中的表达显著低于正常卵巢组织和良性卵巢肿瘤组织，差异有统计学意义，提示卵巢癌的发生可能与自噬活性的降低有关。Atg5 位于人类染色体6q21，包含384 个核苷酸多态性位点(single nucleotide polymorphism，SNP)，编码276 个氨基酸［7］。在自噬体膜形成的早期阶段，需要两个类泛素蛋白系统介导:Atg5-Atg12和Atg8-PE.Atg5 与Atg12 形成的复合物，定位于自噬体膜的表面促进自噬体膜的伸展扩张，诱导自噬体的形成，在酵母和哺乳动物中去除Atg5 能阻滞自噬［8］，因此，Atg5 在自噬中起重要作用。本研究通过免疫组化和RT-PCR 显示，Atg5 在上皮性癌组织中的表达显著低于正常卵巢组织和良性卵巢肿瘤组织，提示上皮性卵巢癌组织中存在Atg5 表达的缺失和下调。自噬发生时，Atg5 的形成量减少，即在上皮性卵巢癌组织中自噬活性下降，这种可变性可能参与了上皮性卵巢癌的发生。对Beclin1、Atg5 蛋白表达与上皮性卵巢癌临床病例参数关系的分析表明，随着肿瘤分化程度的下降以及FIGO 分期的提高，Beclin1、Atg5 表达减少，提示上皮性卵巢癌的进展可能与自噬活性的下降有关。

本研究通过免疫组化和RT-PCR 的方法比较正常卵巢组织、良性卵巢组织及上皮性卵巢癌组织中Beclin1 和Atg5 的表达，研究结果表明Beclin1和Atg5 在上皮性卵巢癌中的表达显著降低，提示上皮性卵巢癌的发生发展可能与自噬活性的下降有关。目前自噬的机制尚未完全阐明，随着对自噬进一步的研究，可了解自噬在肿瘤发生发展的具体过程，为上皮性卵巢癌的治疗提供新的靶向治疗方案。

［1］Filiz B，Derya G，Serk E，et al．Maspin overexpression correlates with increased expression of vascular endothelia l growth factors A，C，and D in human ovarian carci-noma［J］．Pathol Res Pract，2008，204:379－387．

［2］Meijer A J，Codoguo P．Regulation and role of autophagy in mammalian cells［J］．Int J Biochem Cell Biol，2004，36:2445－2462．

［3］Li J，Ni M，Lee B，et al．The unfolded protein response regulator GRP78/BiP is required for endoplasmic reticulum integrity and stress-induced autophagy in mammalian cells［J］．Cell Death Differ，2008，15:1460－1471．

［4］Pattingre S，Espert L，Biard-Piechaczyk M，et al．Regulation of macroautophagy by mTOR and Beclin 1 complexes［J］．Biochimie，2008，90:313－323．

［5］Yue Z，Jin S，Yang C，et al．Beclin 1，an autophagy gene essential for early embryonic development，is a haploinsufficient tumor suppressor［J］．Proc Natl Acad Sci U S A，2003，100:15077－15082．

［6］Futreal PA，Liu Q，Shattuck-Eidens D，et al．BRCA1 mutations in primary breast and ovarian carcinomas［J］．Science，1994，266:120－122．

［7］Yousefi S，Perozzo R，Schmid I，et al．Calpain-mediated cleavage of Atg5 switches autophagy to apoptosis［J］．Nat Cell Biol，2006，8:1124－1132．

［8］Mizushima N，Sugita H，Yoshimori T，et al．A new protein conjugation system in human:The counterpart of the yeast Apgl2p conjugation system essential for autophagy．［J］Biol Chem，1998，273:33889－33892．