能同时降解呕吐毒素、玉米赤霉烯酮和黄曲霉毒素的芽孢杆菌筛选

徐海军，李 慧，张德华，夏伦斌，余道伦，高俊梅

（1.皖西学院生物与制药工程学院，安徽 六安 237012；2.安徽九鼎农业科技发展股份有限公司，安徽 六安 237000）

霉菌毒素是由真菌产生的有毒有害物质。土壤、植物和青贮饲料中均可发现霉菌毒素。霉菌毒素既可在农作物大田收获时形成，在不适宜的贮存条件下，也可继续在收获后的农作物上形成。较高的湿度通常有利于饲料中霉菌的生长和霉菌毒素的产生。饲料中检出率比较高和对动物影响比较大的霉菌毒素主要有黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和呕吐毒素。

黄曲霉毒素主要是黄曲霉菌和寄生曲霉菌的二次代谢产物，其化学结构类似，均为二氢呋喃香豆素的衍生物。一般来说，温度30 ℃、相对湿度80%、谷物水分在14%以上（花生的水分在9%以上）最适合黄曲霉菌繁殖和生长。在24～34 ℃，黄曲霉菌产毒量最高。

呕吐毒素又称脱氧雪腐镰刀菌烯醇，主要是由禾谷镰刀菌和黄色镰刀杆菌产生的化学结构和生物活性相似的有毒代谢产物（单端孢霉烯族化合物中的一种）构成，主要污染小麦、大麦、玉米等谷类作物，也污染粮食制品。人和动物在误食被该毒素污染的粮谷类后可以产生广泛的毒性效应。

玉米赤霉烯酮又称F2毒素，是由禾谷镰刀菌等菌种产生的有毒代谢产物，是一种雌激素真菌毒素。玉米赤霉烯酮主要污染玉米、麦类、谷物等，在世界各地各种粮谷与饲料中均有存在。玉米赤霉烯酮具有较强的生殖毒性和致畸作用，可引起动物发生雌激素亢进症，导致动物不孕或流产，对家禽、猪、牛和羊的影响较大，给畜牧业带来很大的经济损失。

霉菌毒素的生物降解是近年来国内外霉菌毒素脱毒技术方面的一个研究热点。徐剑宏等[1]用脱氧雪腐镰刀菌烯醇多次传代富集培养从小麦的土壤中分离到一株霉菌毒素降解菌，该菌对不同单端孢霉烯族毒素的降解率达到90%以上。牛天贵等[2]用香豆素为唯一碳源的培养基，以动物粪便、发霉粮食、腐败饲料、枯枝败叶和发酵食品为实验材料，先进行初筛，获得能降解香豆素的菌株，再分别以黄曲霉毒素B1或赭曲霉毒素A为唯一碳源的培养基进行第2次筛选，结果获得一株对黄曲霉毒素B1和赭曲霉毒素A均能降解的地衣芽孢杆菌。进一步试验表明，此地衣芽孢杆菌对玉米面中低浓度和高浓度的黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A均能有效降解，降解率分别达到82.9%、78.3%和75.0%、73.5%。陈志敏等[3]分别将黄曲霉毒素降解菌、玉米赤霉烯酮降解菌和呕吐毒素降解菌进行发酵培养，然后通过固液分离、超滤浓缩获得3种细菌的霉菌毒素降解酶液，复合配制成霉菌毒素降解酶制剂，对饲料霉菌毒素的去除率达到80%以上。这些研究表明应用酶解技术降解饲料中的霉菌毒素具有很好的应用前景。

产酶益生素可以提高畜禽对日粮的消化利用率，减少粪便排放量，提高畜禽的生产性能。芽孢杆菌以芽孢形式存在时，对环境的抵抗力强，在适宜条件下又可复活，恢复生物学功能。因此，芽孢杆菌是生产益生素的良好菌种。本研究旨在筛选对黄曲霉毒素B1、呕吐毒素和玉米赤霉烯酮均有较好降解作用的芽孢杆菌，以便为开发具有霉菌毒素降解作用的新型产酶益生素奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 猪粪

安徽九鼎农业科技发展股份有限公司原种场中的健康成年母猪正常粪便。

1.1.2 培养基

营养琼脂培养基：蛋白胨0.5 g、牛肉膏0.3 g、琼脂1.5 g、蒸馏水100 mL，pH7.2～7.4。

富集培养基(牛天贵，2009)：(NH4)2HPO40.1 g、KH2PO40.1 g、Na2HPO40.2 g、Na2SO40.05 g、NaNO30.1 g、3种霉菌毒素(黄曲霉毒素B1、呕吐毒素和玉米赤霉烯酮)适量(第1、2和3次富集浓度分别为1、5、10 mg/L)、 蒸 馏 水100 mL，pH7.2～7.4。

霉菌毒素降解菌定向筛选培养基(牛天贵，2009)：蛋白胨0.5 g、牛肉膏0.3 g、霉菌毒素 0.5 mg、蒸馏水 100 mL、pH 7.2～7.4。

1.1.3 主要试剂

玉米赤霉烯酮、呕吐毒素和黄曲霉毒素标准品购自天津一方科技有限公司。玉米赤霉烯酮、呕吐毒素和黄曲霉毒素的ELISA检测试剂盒购自北京华安麦科生物技术有限公司。

1.1.4 主要仪器

手提式高压灭菌锅（上海锐风仪器制造有限公司）、SW-CJ-2FD双人单面超净工作操作台（苏州净化设备有限公司）、TGL-16台式高速离心机（金坛市岸头良友实验仪器厂）、GHX-9080B型隔水式恒温培养箱（上海福玛实验设备有限公司）、旋转蒸发仪（上海比朗仪器有限公司）、GKC214数显控温水浴锅（上海苏进仪器设备厂）、生物显微镜（上海沪粤明科学仪器有限公司）、318MC型酶标仪（上海三科仪器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 霉菌毒素降解菌的富集培养

称取0.5 g母猪粪便放入灭菌试管中，加入5 mL灭菌生理盐水，用灭菌吸管充分吸吹混匀。用无菌纱布封好试管口后，放入80 ℃水浴中加热15 min杀死非芽孢菌，取出冷却后，用无菌生理盐水按100倍、1 000倍、10 000倍梯度稀释样品。分别取各稀释度的样品溶液100 μL涂布接种于营养琼脂培养基平板上，37 ℃培养7 d，直到菌落充分长出。

将各平板上长出的菌落用灭菌生理盐水洗下，混合后作为原始菌液，约8 mL。将原始菌液放入80 ℃水浴中加热15 min以充分杀死非芽孢菌，冷却后吸取100 μL涂布接种于营养琼脂平板上，37 ℃培养24 h。将长出的菌落用5 mL灭菌生理盐水洗下，吸取100 μL菌液接种到5 mL第1次富集培养基中，37 ℃振荡培养1周。取100 μL第1次富集培养菌液，传代接种于5 mL第2次富集培养基中，37 ℃振荡培养1周，再取100 μL所得培养物，传代接种于5 mL第3次富集培养基中，37 ℃振荡培养1周。这样共传代富集3次。

1.2.2 霉菌毒素降解菌的定向筛选

1.2.2.1 能降解呕吐毒素的芽孢杆菌定向筛选 将最终富集培养获得的菌液10 000 r/min离心15 min，弃上清液，向沉淀中加入无菌生理盐水5 mL，10 000 r/min离心15 min，弃上清液，同法清洗3次以除去富集培养菌液中残留的富集培养基液。最后一次离心获得的细菌沉淀，用5 mL灭菌生理盐水悬浮。取100 μL菌液接种于5 mL呕吐毒素降解菌定向筛选培养基中，37 ℃振荡培养48 h。用接种环蘸取菌液划线接种于营养琼脂培养基上，37 ℃培养24 h。挑取营养琼脂平板上长出的单菌落分别接种于5 mL呕吐毒素降解菌定向筛选培养基中，37 ℃培养48 h。分别将各单菌落的培养液在10 000 r/min离心15 min，吸取各自上清2 mL，用呕吐毒素ELISA检测试剂盒测定呕吐毒素含量（T1），测定方法参照试剂盒说明书。以呕吐毒素降解菌定向筛选培养基的呕吐毒素含量（T0）为参照，计算各单菌落对呕吐毒素的降解率：x(%)=（T0-T1）/T0×100%。

1.2.2.2 能降解玉米赤霉烯酮的芽孢杆菌定向筛选 将对呕吐毒素降解率达70%以上的呕吐毒素降解菌分别转接到玉米赤霉烯酮定向筛选培养基中，37℃培养48 h。参照呕吐毒素降解率的测定方法，用玉米赤霉烯酮ELISA检测试剂盒检测玉米赤霉烯酮含量，并计算培养后玉米赤霉烯酮的降解率。

1.2.2.3 能降解黄曲霉毒素B1的芽孢杆菌定向筛选 将对玉米赤霉烯酮降解率达70%以上的玉米赤霉烯酮降解菌分别转接到黄曲霉毒素B1定向筛选培养基中，37 ℃培养48 h。参照呕吐毒素降解率的测定方法，用黄曲霉毒素B1 ELISA检测试剂盒检测培养前后培养液中黄曲霉毒素B1含量，并计算培养后黄曲霉毒素B1的降解率。

1.2.3 目标细菌的形态观察

选取对呕吐毒素、玉米赤霉烯酮和黄曲霉毒素B1综合降解率最理想的菌种作为目标菌种。将目标菌种划线接种于营养琼脂培养基上，37 ℃培养24 h。观察记录菌落形态。挑取单菌落，制成涂片，分别进行革兰氏染色和美兰染色，观察其菌落形态。

2 结果和分析

2.1 霉菌毒素降解菌的富集培养结果

图1 不同深度猪粪溶液涂布接种于营养琼脂平板上的细菌生长结果

本实验的目标是获得能同时降解主要霉菌毒素的芽孢杆菌。为了减少非芽孢菌的影响，本实验将猪粪稀释液加热后用于培养。尽管如此，猪粪溶液在不高于1:1 000稀释时，涂布接种于营养琼脂平板上后，仍可长出大量菌落（见图1）。说明猪粪中的芽孢杆菌数量非常多，这在理论上为筛选出对呕吐毒素、玉米赤霉烯酮和黄曲霉毒素B1能同时降解的芽孢杆菌提供了可能性。为了进一步减少非芽孢菌对后续实验的影响，本实验对猪粪初次分离菌再一次加热后才用于富集培养。

表1 呕吐毒素降解菌定向筛选结果 %

表2 玉米赤霉烯酮降解菌定向筛选结果 %

表3 黄曲霉毒素B1降解菌定向筛选结果 %

本实验的富集培养进行了3次，每次培养时间为1周。采用较长的培养时间和反复富集培养有利于提高最终菌液中霉菌毒素降解菌的比例。

2.2 霉菌毒素降解菌定向筛选的结果

本实验先用呕吐毒素进行定向筛选，结果获得10株对呕吐毒素降解率达70%以上的菌株，分别命名为ODS-1、ODS-2、ODS-3、ODS-4、ODS-5、ODS-6、ODS-7、ODS-8、ODS-9和ODS-10（见表1）。再用玉米赤霉烯酮对这10株细菌进行定向筛选，结果ODS-1、ODS-2、ODS-5和ODS-8对玉米赤霉烯酮的降解率也达到70%以上（见表2）。最后用黄曲霉毒素B1对ODS-1、ODS-2、ODS-5和ODS-8进行定向筛选，结果只有ODS-1对黄曲霉毒素B1的降解率达70%以上（见表3）。因此，本实验中筛选到的ODS-1对这3种霉菌毒素均有较好的降解率，是本研究的目标细菌。

2.3 目标细菌的形态观察

ODS-1菌株在营养琼脂平板上生长迅速，培养时间较短时即可长成灰白色、半透明、圆形、表面光滑的菌落，培养时间较长时菌落表面可皱缩（见图2）。革兰氏染色镜检结果表明ODS-1菌株为革兰氏阴性杆菌（见图3）。

3 讨论

图2 ODS-1在营养琼脂平板上生长时的菌落形态

图3 ODS-1细菌形态。A:革兰氏染色；B:美兰染色。

霉菌毒素对畜牧业和人类健康都有极大的危害。饲料中霉菌毒素的污染是一个普遍现象。虽然物理吸附是当前控制饲料霉菌毒素污染的主要途径，但物理吸附剂常常只对某一种霉菌毒素有较强选择性，对其他种类的霉菌毒素选择性不强，并且物理吸附剂还易导致对营养素的吸附，从而可能影响营养素的吸收。霉菌毒素的生物降解技术具有安全性高、特异性强的优点而被人们寄于厚望。以往的研究大多仅侧重于筛选对某一种霉菌毒素有降解作用的细菌。由于饲料中污染的霉菌毒素种类繁多，特别是黄曲霉毒素B1、呕吐毒素和玉米赤霉烯酮是最常见的霉菌毒素。所以，筛选能对这3种霉菌毒素都具有较好降解作用的细菌非常重要，有利于降低生产成本。许多研究表明，一些细菌对霉菌毒素的降解具有多能性，即能同时降解不同结构类型的霉菌毒素。例如，牛天贵等(2008)[2]就筛选获得一株对黄曲霉毒素B1和赭曲霉毒素都具有较好降解作用的芽孢杆菌。徐剑宏等(2008)[3]则筛选到一株不产芽孢的德沃氏菌，该菌对饲料中呕吐毒素、黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的降解率分别达到95.3%、92.4%和75.6%。本研究中筛选到的ODS-1菌株对呕吐毒素、玉米赤霉烯酮和黄曲霉毒素B1的降解率也分别达到96.2%、94.6%和78.9%，这为将其开发成霉菌毒素降解菌剂奠定了基础。

和非芽孢菌相比，芽孢杆菌具有优良的抗逆性，能耐受饲料制料和贮存过程中的不利生存条件。因此，芽孢杆菌更有利于在实际生产中应用。同时，芽孢杆菌也常常是优良的益生菌，在畜禽的肠道中可以分泌消化酶，拮抗病原菌的生长。本研究从母猪粪便中筛选到一株对饲料中污染的主要霉菌毒素（呕吐毒素、玉米赤霉烯酮和黄曲霉毒素B1）均有较好降解作用的芽孢杆菌，为开发具有霉菌毒素降解功能的新型产酶益生素提供了新思路。对于ODS-1菌株的确切鉴定还需进一步研究。

[1] 陈志敏,丁宏标,乔宇,等.一种生物降解饲料中霉菌毒素的复合酶：中国，200910241454.7[P].2009-12-09.

[2] 牛天贵,梁志宏,计成，等.一株能同时降解黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A的菌株的筛选、培养和应用：中国，200810224726.8[P].2008-12-10.

[3] 徐剑宏，史建荣，陆琼娴，等.一种能对霉菌毒素降解的菌株及其制剂的制备方法：中国，200810122672.4[P].2010-06-09.