绿藻浓度荧光检测系统的研究

尹文佳，李彧，徐元哲

(1.东北电力大学自动化工程学院，吉林吉林132012;2.琼州学院理工学院，三亚572022)

近年来，世界经济的迅速发展，湖泊水体富营养化程度加剧、绿藻等藻类过度繁殖堆积水面、水体中大量生物因缺氧而死亡，进而造成水华现象的爆发，严重的危害了人们日常生产、生活、生命健康和生态环境。为了做好水华现象的预警工作，国内外大部分学者对水体中藻类浓度测量展开了研究［1－4］。

水体富营养化可以通过检测绿藻中叶绿素含量来实现，其中叶绿素－a含量最高。叶绿素－a的浓度是表征水体富营养化程度的主要参数［5］，现有的对于叶绿素－a浓度的检测方法有分光光度法、高效液相色谱法、实验室荧光光谱法和遥感法。前三种方法都可以归结为实验室法，都需要对藻类等浮游植物进行叶绿素的萃取工作，操作步骤十分繁琐，而且大多需要有经验者做出经验分析。遥感航拍的方法固然可以大面积测量水域的叶绿素－a浓度，但是由于航线、背景光以及高度的限制，在测量精度方面难以保证。

本研究设计了一种以高亮度、强稳定性的紫色激光调制光作为激发光源，将光学技术、荧光检测技术和对数式除法电路相结合的快速检测叶绿素－a浓度的装置，实验结果表明该装置在保证测量精度的条件下，实用性好，操作简单，稳定快速，为叶绿素－a检测技术提供了新的思路。

1 测量原理

当用一特定波长的光照射某种物质的分子时，受到激发后的分子会以辐射跃迁形式将其吸收的能量释放返回基态时，便会发射出波长大于激发光的光，称之为荧光［6］。不同的荧光物质，由于它们分子结构和能量分布的差异，各自显示出不同的吸收光谱和荧光光谱特性［7］。如图1所示为大量实验后得到的叶绿素－a分子的激发光谱和荧光发射光谱。我们可以清晰地看到，当激发光中心波长为435 nm时，叶绿素－a分子发出峰值荧光波长为685 nm的荧光。

图1 叶绿素－a的激发光光谱和荧光发射光谱

藻类叶绿素－a分子经过某一特定波长激发后，所发射的荧光强度为:

其中，k为仪器常数;Q为物质荧光效率;I0为激励光光强;c为物质浓度;b为样品光程差;ε为摩尔吸收系数。

只要k，Q，I0，b，ε一定，则c和F成一定数学关系。由于浮游植物浓度不只在同一个数量级，故采用对数形式，将(1)式取对数得:

当待测量的荧光物质确定后A、B、D均为常数，由(2)式可知，叶绿素－a浓度只与荧光强度有关，故采用荧光方法检测叶绿素－a浓度是可行的。由于荧光强度会因光源的不稳定发生变化，影响测量的准确性，故本研究将其转化为荧光比值来计算叶绿素－a的浓度。

2 系统设计

该装置主要监测系统的设计图如图2所示。

在光学传感器模块中，激发光源采用自身带有负反馈的功率为50 mw，中心波长为435 nm的紫色激光头，由STC89C51单片机控制发出的频率为2 KHz的调制波。该光源较之以往的氙灯、LED等光源具有高稳定性、强持续性以及高亮度、低损耗等特点，可保证光源精度以及硬件电路的简易性。在探头内部435 nm干涉滤光片下面放置的分光棱镜将一定比例的紫色激光引出，作为参考光使用。探头中部为测量槽，同时装有四根直角镀膜棱镜，应用光的全反射原理，使荧光以极小的损失率全部被收集起来。在685 nm干涉滤光片下方放置的凸透镜将产生的荧光全部汇聚照射到放置于焦点处的光电二极管上，减少能量损失。

在对数式除法电路模块中，为了避免各种外界因素及电路自身的微小变化造成激发光源的不稳定性，导致荧光值也随之变化，故采用分光棱镜将一部分参考光引出，将其转变后的电压信号值与荧光转变后的电压信号值作比，其原理图如图3所示［8］。将参考光电压值u1和荧光电压值u2分别从U1A和U1B的输入端送入，u1与u2分别通过对数运算电路，得到的输出信号在经过减法电路和指数运算电路，最终的输出信号u0与u1/u2成正比，得到一个u1与u2的比值。这样即可剔除由于整个系统各种原因造成光源的不稳定性而带来的荧光值的浮动现象，使得激发光强与荧光值的线性度更好。

图2 硬件电路设计框图

图3 对数式除法电路原理图

3 实验结果与分析

3.1 实验条件

光学传感器长度为8 cm，内直径为25 cm，外直径为30 cm，为了减少背景光干扰，传感器内部反光性高，探头密封性良好，材料为钢制，内壁为铬涂层。将实验室浓度为0.1 μg/L的绿藻按一定的比例配置成不同浓度的溶液，分别为:20%、40%、60%、80%、100%。采用单一变量法，用不同光强的激发光对不同浓度藻类溶液进行激发，使其发射荧光。将激发光强电压与产生的荧光电压应用对数式除法作比后的比值称为荧光比值。研究激发光强与荧光比值在的变化关系，以及浓度值与荧光比值的变化关系，并对实验结果进行分析总结。

3.2 实验内容

3.2.1 激发光强与荧光比值实验

用不同光强的激发光照射不同浓度藻类溶液，应用对数式除法电路后，观测电压输出比值，测试数据如表1所示。

表1 测试数据

对表1中的数据进行仿真，其对应的激发光强与荧光比值之间的关系曲线如图4所示。从图4中可以看出:应用差分方法后，激发光强与荧光比值的线性关系良好，但并不是激发光强越强，其荧光电压比值越高的，选取中段线性效果最好，故可采用激发光强为57 Lm/m2。

图4 激发光强与荧光比值关系

3.2.2 浓度值与荧光比值实验

用频率为2 kHz，光强为57 Lm/m2的激发调制光照射不同浓度藻类溶液，观测电压输出比值，实验数据如表2所示。

表2 测试数据

对表2中数据进行线性拟合，可见绿藻溶液浓度百分比与荧光比值之间的关系曲线如图5所示。函数关系式为y=4.375 0 x+0.201 3，线性回归分析得相关系数为0.998 7，说明叶绿素a检测装置测得的荧光比值与叶绿素a溶液浓度线性关系良好。

通过实验与数据分析，结果表明:系统设计合理实用，测量精度为0.02 μg/L，绿藻浓度与荧光比值成明显线性关系，线性相关系数为0.998 7，不论是在测量精度还是线性度上，较之以往的藻类浓度监测系统都更好些。

图5 浓度与荧光电压比值关系

4 结论

本文设计的光学传感器装置基本完成了从对激发光的控制到荧光的收集，再到两组电压信号的放大和作比值，最后实现绿藻浓度值与荧光比值的一一对应。其优点在于:稳定快速、简单方便、造价低廉、实用效果好。

［1］赵友全，魏红艳，李丹等.叶绿素荧光检测技术及仪器的研究［J］.仪器仪表学报，2010，31(6):1342－1346.

［2］纪建伟，谢飞，Jeremy Harbinson.LED激发光源叶绿素荧光参数在线监控系统［J］.农业工程学报，2009，25(4):145－149.

［3］J.L.Mouget.G.Tremblin.Suitability of the Fluorescence Monitoring System for measurement of photosynthetic characteristics in algae［J］.Aquatic Botany，2002，74(3):219－231.

［4］高洪峰，焦念志.通过藻类色素分析估测海洋浮游植物生物量和群落组成的研究进展［J］.海洋科学，1997(3):51－53.

［5］郑龙江.光纤式海藻叶绿素a浓度的荧光测量理论与实验研究［D］.秦皇岛:燕山大学电气工程学院，2001.

［6］金海龙，汪翔，王玉田.便携式全光纤海藻叶绿素a浓度测量仪的研究［J］.仪器仪表装置，2004(1):23－25.

［7］张国雄.测控电路［M］.北京:机械工业出版社，2008:129－134.