胆囊癌组织bcl-2和p53基因甲基化水平研究

朝乐孟，李全福

(1.承德医学院，河北承德 067000;2.内蒙古自治区人民医院)

胆囊癌组织bcl-2和p53基因甲基化水平研究

朝乐孟1，李全福2△

(1.承德医学院，河北承德 067000;2.内蒙古自治区人民医院)

目的:探讨胆囊癌组织总甲基化水平、bcl-2和p53基因甲基化水平在胆囊癌发病中的作用。方法:改进的酶联免疫吸附技术检测45例胆囊癌组织和40例胆囊炎组织基因组总甲基化水平，应用甲基化特异性PCR技术检测bcl-2和p53基因甲基化水平，应用荧光RT-PCR技术检测bcl-2和p53 mRNA的表达。结果:胆囊癌组织基因组总甲基化水平明显低于胆囊炎，差异具有统计学意义(P＜0.05)。胆囊癌组织p53基因甲基化发生率高于胆囊炎(64.4% vs 17.5%)，差异具有统计学意义(P＜0.05);胆囊癌组织bcl-2基因甲基化发生率与胆囊炎比较差异无统计学意义(17.8% vs 15.0%，P＞0.05)。胆囊癌组织bcl-2 mRNA的表达明显高于胆囊炎、p53 mRNA的表达明显低于胆囊炎，差异具有统计学意义(P＜0.05)。结论:基因组总甲基化水平降低和p53高甲基化可能是胆囊癌发生的分子机制之一。

胆囊癌;总甲基化水平;bcl-2;p53;DNA甲基化

胆囊癌(GBC)是一种罕见且恶性程度较高的肿瘤，发病率存在地区和种族差异[1-2]。GBC与慢性胆囊炎(CC)密切相关，所有GBC标本均有炎症表现,但目前GBC发生的病理生理机制还不清楚[1]。DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶作用下通过共价修饰添加一个甲基至DNA双链的胞嘧啶上，形成5-甲基胞嘧啶(5-mC)。在肿瘤的发生中广泛存在DNA甲基化，一般表现为基因组总甲基化水平降低，癌基因去甲基化表达增加，抑癌基因高甲基化表达降低。bcl-2和p53基因是细胞凋亡途径的两个重要因子，bcl-2为癌基因，p53为抑癌基因。目前，有关胆囊癌组织基因组总甲基化水平和bcl-2、p53基因的甲基化水平变化的研究较少，本研究通过研究候选基因的甲基化水平，以期为进一步阐明GBC的病理学机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 临床资料 2007年至2011年于内蒙古自治区医院行胆囊切除术的组织病理学标本。45例GBC标本，男11例、女34例，年龄32-89岁，平均62±7.5岁;其中腺癌41例、鳞腺癌3例、鳞癌1例;38例为进展期胆囊癌，浸润至浆膜层25例(55.6%，25/45)、浸润浆膜下层13例(28.9%，13/45)，其余7例为早期胆囊癌，仅浸润至粘膜层或粘膜肌层。40例CC患者，男8例、女32例，年龄33-81岁，平均51±6.8岁。所有标本取出后立即置入液氮中保存。

1.2 检测胆囊组织基因组总甲基化水平 采用Promega DNA Purification Kit提 取胆囊 组 织基因 组DNA，NanoDrop1000紫外分光光度计检测基因组DNA浓度，使用Epigentek公司生产的基因组总甲基化定量试剂检测样本的基因组总甲基化水平，于波长450nm处读取吸光度值，计算基因组甲基化水平[公式中的41%是指人类基因组中鸟嘌呤和胞嘧啶(GC)的平均含量]。

1.3 基因组DNA亚硫酸盐修饰 纯化的基因组DNA经NanoDrop1000紫外分光光度计检测基因组DNA浓度后，使 用ZYMO公 司EZ DNA Methylation-Gold Kit进行DNA亚硫酸盐修饰。经修饰后的基因组DNA，非甲基化C转变为U，在PCR反应中扩增为T，而5-mC不变。取基因组DNA 500ng，去离子水稀释至20μl，加入130μl CT转化剂，98℃孵育10min、64℃孵育120min后，经脱硫、洗脱、孵育等步骤后每个样本获得10μl亚硫酸氢盐修饰后的基因组DNA，-80℃保存，用于后续PCR反应。

1.4 甲基化特异性PCR(MSP)检测胆囊组织bcl-2和p53基因甲基化水平 所用引物由Invitrogen公司合成。bcl-2甲基化引物:上游:5’-ATATACGGTTAGAAAGG GTTTAGGC-3’，下游:5’-CCATAAAAACAAAAA CTAA AA AAACG-3’;bcl-2非甲基化引物:上游:5’-ATATG GTTAGAAAGGGTTTAGGTGA-3’，下游:5’-CCATAAA AACAAA AACTAAAAAAACAC-3’，产物长度为156bp。p53基因甲基化引物:上游:5’-TGATTAGGAATTATT GAG AAA TC GA-3’，下游:5’-ACCTCTACCCCCTTTA CTTAACG-3’;p53基因非甲基化引物:上游:5’-TGATT AGGAATTATTG AGAAATTGA-3’，下游:5’-AAACCTC TACCCCCTTTACTTAACA-3’，产物长度172bp。

使用Bio-rad生物MyCyclerTMPCR系统进行扩增，94℃预变性2min，94℃ 30s，67℃(p53 65℃)10s，72℃ 30s，35个循环，72℃ 10min。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳。

1.5 RNA提取和荧光RT-PCR Trizol法提取胆囊组织总RNA，NanoDrop1000紫外分光光度计检测RNA的纯度，2%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，使用Promega公司Universal RiboClone®cDNA Synthesis System逆转录为cDNA。bcl-2和p53引物由Invitrogen公司合成，内参基因为GAPDH。引物:bcl-2上游:5’-GGGTGTGAACCACGA GAAAT-3’，下游:5’-ACTGTGGTCATGAGCCACGAGAA AT-3’，产物长度135bp;p53上游:5’-GATTGTGGCCTTCT TTGAGTTC-3’，下游:5’-CGGTTCAGGTACTCAGTCATC T-3’，产物长度111bp。使用美国ABI7500荧光定量PCR仪和Promega公司Access RT-PCR System进行扩增。反应条件:预变性95℃,10min，1个循环;变性95℃，15s;退火60℃，60s;变性和退火40个循环。根据Schmittgen等[3]相对定量法2-△CT公式计算目的基因mRNA的相对表达量。

1.6 统计方法 采用SPSS 17.0统计软件处理数据，计量资料以(±s)表示、行t检验，计数资料行卡方检验。

2 结果

2.1 胆囊组织基因组总甲基化水平 CC组织基因组总甲基化水平为(6.278±0.91)%，明显高于GBC的基因组总甲基化水平(4.87±1.1)%，差异具有统计学意义(P＜0.05)。

2.2 MSP检测结果 通过甲基化引物(M)和非甲基化引物(U)扩增的PCR产物行琼脂糖凝胶电泳，只要出现甲基化条带，即认为发生了甲基化。45例GBC，8例bcl-2基因发生甲基化，发生率17.8%;40例CC，6例bcl-2基因发生甲基化，发生率15.0%;GBC bcl-2甲基化发生率与CC比较无显著差异(P＞0.05)。45例GBC，29例p53基因发生甲基化，发生率64.4%;40例CC，7例p53基因发生甲基化，发生率17.5%;GBC p53基因甲基化发生率明显高于CC，差异具有统计学意义(P＜0.05)。见附图。

附图 MSP检测GBC和CC bcl-2、p53基因甲基化水平(M:甲基化 U:非甲基化，1-4为患者代码)

2.3 荧 光RT-PCR结 果 GBC bcl-2基 因mRNA表 达水平为(0.66±0.16)，CC bcl-2基因mRNA表达水平为(0.33±0.14)，二者比较差异有统计学意义(P＜0.05)。GBC组织p53基因mRNA表达水平为(0.55±0.17)，CC组织p53基因mRNA表达水平为(0.90±0.10)，二者比较差异有统计学意义(P＜0.05)。

3 讨论

目前，有关GBC的表观遗传学研究相对有限，bcl-2和p53基因甲基化水平的变化在GBC发病中的作用还不清楚。本研究发现，GBC发生过程中，与CC相比，基因组总甲基化水平降低，bcl-2基因甲基化水平无明显变化，而p53基因甲基化水平明显升高。

基因组总甲基化水平降低会导致基因组不稳定，从而参与肿瘤形成[4]。本研究发现，GBC基因组总甲基化水平降低。虽然在其它实体肿瘤中，基因组低甲基化是普遍现象，但有关GBC基因组总甲基化水平的报道尚少，本研究进一步证实了这一现象。有研究人员甚至建议，把基因组总甲基化水平作为一种生物学标志物用于肿瘤的筛查、风险评估和预后判断等[5]。

p53基因是迄今发现的与人类肿瘤相关性最高的基因，具有阻滞细胞周期、抑制细胞增殖、诱导细胞分化、启动细胞凋亡、维持基因组稳定的作用[6]。Jha等[7]报道，宫颈癌中p53基因表现为高甲基化状态。本研究亦发现，GBC组织p53高甲基化，p53 mRNA表达降低。高甲基化导致的抑癌基因p53低表达可能是GBC发生的重要机制之一，另外，p53甲基化和p53基因突变是否同时调控，还需进一步验证。

bcl-2是线粒体放大凋亡途径的重要调节因子，表达于线粒体外膜，抑制凋亡形成因子从线粒体释放[8]。bcl-2表达受p53基因调控，上调bcl-2基因表达可抑制细胞凋亡影响细胞周期。Zhu等[9]发现，结肠癌组织bcl-2基因低甲基化，且甲基化与亚甲基四氢叶酸还原酶基因(MTHFR)多态性相关。本研究发现，GBC与CC比较，bcl-2甲基化水平无明显差异，但mRNA表达水平存在差异，表明在GBC的发生中还存在其它调控bcl-2表达的方式，有待于进一步研究。

总之，GBC的发生受遗传和环境的双重影响，亦有地域差异，表观遗传学调节方式在其发生中具有重要作用，GBC中其它癌基因和抑癌基因的甲基化状态需进一步探讨。

[1]Lazcano-Ponce EC,Miquel JF,Munoz N,et al.Epidemiology and molecular pathology of gallbladder cancer[J].CA Cancer J Clin,2001,51(6):349-364.

[2]Misra S,Chaturvedi A,Misra NC,et al.Carcinoma of the gallbladder[J].Lancet Oncol,2003, 4(3): 167-176.

[3]Schmittgen TD,Livak KJ.Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method[J]. Nat Protoc,2008,3(6):1101-1108.

[4]Watanabe Y, Maekawa M. Methylation of DNA in cancer[J].Adv Clin Chem,2010,52(1):145-167.

[5]Kitkumthorn N,Mutirangura A.Long interspersed nuclear element-1 hypomethylation in cancer: biology and clinical applications[J].Clin Epigenetics,2011,2(2):315-330.

[6]Stegh AH.Targeting the p53 signaling pathway in cancer therapy-the promises,challenges and perils[J].Expert Opin Ther Targets,2012,16(1):67-83.

[7]Jha AK,Nikbakht M,Jain V,et al.Promoter hypermethylation of p73 and p53 genes in cervical cancer patients among north Indian population[J].Mol Biol Rep,2012,39(9):9145-9157.

[8]Low IC, Kang J, Pervaiz S. Bcl-2: a prime regulator of mitochondrial redox metabolism in cancer cells[J].Antioxid Redox Signal,2011,15(12):2975-2987.

[9]Zhu Q,Jin Z,Yuan Y,et al.Impact of MTHFR gene C677T polymorphism on Bcl-2 gene methylation and protein expression in colorectal cancer[J].Scand J Gastroenterol,2011,46(4):436-445.

(基础医学栏目编辑:陈志宏)

STUDY ON METHYLATION STATUS OF BCL-2 AND P53 GENE IN GALLBLADDER CARCINOMA

CHAO Le-meng, LI Quan-fu
(Chengde Medical College, Hebei Chengde 067000, China)

Objective:To investigate the potential role of methylation modif i cation (global DNA methylation, bcl-2/ p53) in gallbladder carcinogenesis.Methods:Innovative enzyme-linked immunosorbent assay was used to detect global DNA methylation, methylation- specif i c polymerase chain reaction to detect methylation status of bcl-2 and p53, fl uorescent RT-PCR to detect bcl-2 and p53 mRNA expression in 45 cases gallbladder carcinoma and 40 cases chronic cholecystitis.Results:The global DNA methylation status of gallbladder carcinoma was obviously lower than chronic cholecystitis (P＜0.05). The methylation incidence of p53 in gallbladder was signif i cantly higher than chronic cholecystitis (64.4% vs 17.5%, P＜0.05); While, there had no signif i cant differences about methylation incidence of bcl-2 between gallbladder carcinoma and chronic cholecystitis (17.8% vs 15.0%, P＞0.05). bcl-2 mRNA expression in gallbladder carcinoma was obviously higher than chronic cholecystitis, while p53 mRNA expression in gallbladder carcinoma was obviously lower (P＜0.05).Conclusions:Global DNA hypomethylation and p53 hypermethylation may be an important molecular mechanism in gallbladder carcinoma pathogenesis.

Gallbladder carcinoma; Global DNA methylation; Bcl-2; P53; DNA methylation

735.8

A

1004-6879(2013)01-0010-03

2012-08-13)

△ 通讯作者