胶州湾海域PAHs污染与可培养半知菌的多样性

姜会超, 田 黎, 史振平 张久明

(1.青岛科技大学, 山东青岛 266042; 2.国家海洋局 第一海洋研究所, 山东青岛 266061)

胶州湾海域PAHs污染与可培养半知菌的多样性

姜会超1,2, 田 黎1,2, 史振平1, 张久明1

(1.青岛科技大学, 山东青岛 266042; 2.国家海洋局 第一海洋研究所, 山东青岛 266061)

用5种不同的培养基对胶州湾近岸污染环境可培养半知菌进行选择性分离, 共得到235株半知菌, 其中YM培养基、MPDA培养基对半知菌的分离效果最好, 分别占分离总量的26.4%和24.7%。试验选择的3个站位: 石老人潮间带、海泊河入海口、李村河入海口PAHs含量存在显著性差异(P＜0.05),其中石老人最低, 平均为 113.8 ng/g, 海泊河 PAHs为 324.9 ng/g, 介于中等水平, 李村河含量最高为882.1 ng/g。可培养半知菌群体随PAHs含量的增加表现出先升高后降低的趋势。对各站位的半知菌进行统计发现, 污染不同的站位, 可培养半知菌优势种群不同, 说明PAHs的污染可对半知菌的菌落结构组成产生影响。

胶州湾; PAHs; 半知菌

多环芳烃(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons, PAHs)是一类广泛存在于环境中具有“三致作用”(致癌、致畸、致突变)的有机污染物, 环数越高的PAHs对环境的危害相对越大[1]。PAHs以水体中的悬浮物为主要载体, 进入海洋环境后由于难溶于水而不断累积于沉积物中, 海洋沉积物中的 PAHs的积累量占沉积物中难降解污染物总量的 97%以上, PAHs可通过食物链的富集作用对高等生物以及人类健康产生严重威胁[2-3]。目前化学分析的方法可以较准确地测试海洋中的PAHs含量, 但不同PAHs含量对海洋生物种群的影响很少见有报道。半知菌是海洋环境分布较广的一类真核微生物, 环境污染对其优势种群结构会产生较直观的影响, 而优势种群的变化能够在一定程度上指示环境的污染状况[4-5]。目前尚未见有海洋环境 PAHs污染与半知菌关系的研究报道,本文选择污染比较典型的胶州湾作为试验海域, 通过对可培养半知菌的选择性分离, 获得该海域半知菌分离较适合的分离方法, 对污染程度不同的采样站位的半知菌种群进行统计, 探讨半知菌种群结构对PAHs污染的反映。

1 材料与方法

1.1 站位的确定与样品采集

根据课题组以往调查, 胶州湾海域的李村河(LC)入海口(36°09′N, 120°21′E)、海泊河(HB)入海口(36°06′N, 120°19′E)、石老人(SL)潮间带(36°04′N, 120°27′E) 分别定为重度、中度污染区和轻度污染区的采样站位, 采样以各入海口为中心、根据采样地形间隔 30 m 为一采样点, 取不同沉积物表层(0～20 cm), 共取得12个样品(石老人4个, 海泊河4个,李村河4个), 每个样品由该采样点随机取的3个样混合组成。样品分为两份, 一份装入预清洗的棕色玻璃瓶中用于 PAHs测定, 一份用于半知菌的分离培养。

1.2 PAHs测定

PAHs测定参照薛荔栋等[6]的方法, 并作适当修改:

样品经冷冻干燥后研磨通过80目筛网并混匀。称取筛分混匀样品 10 g, 与 10 g无水硫酸钠混合,利用正己烷和丙酮混合试剂(体积比为 1∶1)索氏提取16～24 h。 提取过程中加入高纯铜粉脱硫,旋蒸氮吹浓缩至2～3 mL,加入50 mL正己烷替换溶剂, 然后浓缩至近干再加入2 mL正己烷。 浓缩提取液通过硅胶/氧化铝(体积比为 1∶2)层析柱(柱顶部填充适量无水硫酸钠和高纯铜粉), 再加入40 mL 正己烷淋洗弃去饱和烷烃。此后, 加入80 mL混合溶剂(二氯甲烷+正己烷, 体积比 3∶7)洗脱得到 PAHs组分,经旋蒸氮吹浓缩至1mL。

PAHs组分采用配有 6890N型气相色谱仪和5975B型质谱检测器的 Agilent GC-MS进行分析。GC/MS条件: 进样口温度是250℃, 柱初始温45℃,保持1 min, 以6℃/min程序升温至200℃, 然后以8℃/min程序升温到300℃, 并保持5 min。载气为氦气, 流量1.0 mL/min。不分流进样, 进样量为1μL。毛 细 管 柱 : HP-5MS(Agilent 19091S-433)30.0 m×250.0μm×0.25μm。质谱条件: 电子轰击离子源模式, 离子源温度为 200℃, 接口温度 280℃, 电子轰击能量70 eV, 选择离子扫描(SIM)方式[7-8]。

1.3 半知菌培养基

海水马铃薯(MPDA)培养基, 燕麦片 ( YM)培养基[9-10], 查氏(CA)培养基、WA培养基、孟加拉红(MJ)培养基、用于真菌分离[11-12]。

为了抑制细菌的干扰, 每种培养基均加入终浓度为50 mg/L的链霉素。

1.4 半知菌分离方法

称取沉积物样品5 g, 在无菌操作下加入盛有50 mL体积分数为50%无菌人工海水的三角瓶中, 用涡旋振荡器充分振荡均匀后, 于200 r/min摇床振荡10 min后静置取上清液5 mL, 加入装有45 mL同样盐分无菌人工海水的三角瓶中, 倍半法稀释使样品终浓度为10-4、10-5。分别取100 μL涂布在5种不同的培养基上, 每个处理3个重复。

将上述分离平板置于25℃恒温培养, 5～15 d, 从培养平板内挑取菌落形态和色素不同单细胞的菌落,做好统计以便进行不同培养基分离效果的比较。对所分离到的半知菌再根据菌株生物学与分子生物学分类标准, 确定半知菌的种属。

1.5 数据处理

实验数据用 SPSS13.0 统计软件进行方差分析,并用duncan法进行多重比较。

2 结果

2.1 PAHs测定结果

表1 沉积物样品PAHs含量测定结果(ng/g)Tab. 1 Concentration of PAHs in surface sediment in different sampling sites(ng/g)

石老人、海泊河、李村河各站位沉积物中16种优先监控的多环芳烃含量测定结果如表1所示。

对各采样点PAHs总量进行统计, 结果如图1所示, 通过表 1及图 1我们可以看出, 石老人站位PAHs污染种类少且含量低, 四个采样点PAHs总量平均值为113.8 ng/g, 海泊河站位PAHs污染物种类比石老人站位多, 除萘未检出外, 其他 14种 PAHs污染物均可检测到, 4采样点总量平均值为 324.9 ng/g, 是石老人站位的 2.9倍; 李村河入海口站位PAHs污染物种类和每种污染物的含量在3个试验区最高, 同时该4采样点PAHs总量波动较大, 最低为327.8 ng/g, 最高为1367.8 ng/g, PAHs总量平均值为 882.1 ng/g, 分别是石老人站位的 7.8倍, 海泊河站位的2.7倍。从各站位PAHs的组成看, 石老人站位PAHs污染主要以3环为主, 含量占50%左右。李村河与海泊河站位 4～5环多环芳烃所占比例较大,含量占60%以上, 对环境的危害较大。

图1 各采样点PAHs总量Fig. 1 Contents of PAHs in different sampling sites

2.2 不同培养基分离效果比较

采用CA、MPDA、YM、WA、MJ5种培养基对石老人、海泊河、李村河三个站位共12个样品进行分离, 对每种培养基在每个采样点分离到的半知菌菌株数目进行统计, 结果如表2所示。

5种培养基在12个采样点共分离到235株半知菌, 其中YM培养基、MPDA培养基分离到半知菌的数量最多, 分别分离到62株、58株, 总共占到分离总量51%。其次是CA和WA培养基, 分别分离到47株、40株, MJ培养基分离到的半知菌数量最少,只分离到28株。

表2 不同培养基选择分离半知菌结果Tab. 2 Statistics of Deuteromycetes species from different isolation medium

对5种培养基的分离结果进行方差分析, 5种培养基的分离效果存在显著性差异(P＜0.05), 具有统计学意义。为进一步探讨各培养基的分离效果, 对其进行多重比较, 结果如表3所示。

由表3可知, YM培养基分离效果最好, 分离到的半知菌种类数比MJ培养基提高了124%, 其次是MPDA、CA、WA培养基, 分离效果分别比MJ培养基提高了108%、70%、43%。MJ培养基分离效果最差。

表3 不同培养基半知菌分离结果多重比较Tab. 3 Multiple comparison of Deuteromycetes species amount from different isolation medium

2.3 不同站位半知菌分布结果

2.3.1 不同站位半知菌菌落总数分布结果

对石老人、海泊河以及李村河三个站位, 12个采样点的半知菌菌落总数进行统计, 结果如表4所示。

由表4可以看出, 从站位上分析, 半知菌菌落总数在石老人、海泊河、李村河三个站位上表现出明显的差异(P＜0.05)。半知菌菌落总数在石老人轻度污染区比较低, 为 7.7×105cfu/g。在海泊河中度污染区半知菌菌落总数含量最高, 达到2.2×106cfu/g。到李村河重度污染区半知菌菌落总数降低到 1.3× 106cfu/g。半知菌菌落总数随着 PAHs污染程度的增加表现出先上升后下降的趋势。

表4 半知菌菌落总数结果 (105cfu/g)Tab. 4 Total amount of Deuteromycetes in different sampling site(105cfu/g)

2.3.2 不同站位半知菌种类分布结果

经过对分离的235株半知菌分类鉴定, 得到25种不同种属的半知菌, 其中青霉 11种(Penicilliumsp.),曲霉8种(Aspergillussp.), 枝霉(Cladosporiumsp.)、镰孢霉(Fusariumsp.)、交链孢霉属(Alternariasp.)、红丝菌疣孢霉(Mycogone rosea)、单孢霉属(Monosporiumsp.)、木霉(Richodermasp.)各一种。对半知菌在每个站位的分布情况进行统计, 结果如图2所示。

图2 半知菌三站位分布Fig. 2 Distributions of Deuteromycetes in different sampling sites.

由图2可知, 团青霉(Penicillium commune)、黄青霉(Penicillium chrysogenum)、灰黄青霉(Penicillium griseofulvum)这3种半知菌在石老人、海泊河、李村河3个站位分布比较普遍, 属于优势种。污染轻的石老人海域还分布有特异青霉(Penicillium notatum)、小刺 青 霉 (Penicillium spinulosum)、 瓶 梗 青 霉(Paecilomyces Bainier)、壳青霉(Penicillium crustosum)、木霉(Richodermasp.)等, 显示良好的半知菌多样性; 扩展青霉(Penicillium expansum)、黄曲霉(Aspergillus flavus)、交链孢霉属(Alternariasp.)棒曲霉(Aspergillus clavatus)、红丝菌疣孢霉属(Mycogone rosea)、单孢霉属(Monosporiumsp.)萨氏曲霉(Aspergillus sydowi)在污染较重的海泊河、李村河分布较多, 其中棒曲霉(Aspergillus clavatus)、红丝菌疣孢霉属(Mycogone rosea)以及单孢霉属(Monosporiumsp.)只出现在海泊河轻度污染区, 萨氏曲霉(Aspergillus sydowi)只出现在李村河重度污染区。

3 讨论

胶州湾的海泊河入海口、李村河入海口流经青岛市主要的重工业区, 沿岸居民区密布, 汇集大量城市废水废物, 对周围环境和生物群体结构造成较大影响。课题组以往有关该区域的重金属、氮磷的调查显示, 石老人、海泊河、李村河三站位污染级别由轻到重[4],本文的PAHs含量也表现相同趋势。目前对于海洋 PAHs污染等级的划分还没有一个统一的标准, 国内外研究大多采用1995年Long等[13-14]提出的L-ER-M效应评估法。按照此评估法, 采样的3个站位PAHs含量尚未超过最低危害值。但已引起半知菌菌落结构的较明显变化, 除了其他污染物的综合效应外, PAHs对生物的危害不容忽视。

目前对微生物多样性的评估不少研究都使用分子生物学手段, 但可培养种类涉及该生境微生物的进一步利用, 如污染指示、污染降解等, 在环境调查与研究中也是必不可少, 污染海洋环境半知菌的分离与调查, 国内外均未见有相关报道,

本研究进行了有益的探索, 获得的结果证明: YM 培养基对半知菌的分离效果最好, 分离到的半知菌种类最为丰富, 不但将样品中广泛存在的团青霉(Penicillium commune)、黄青霉(Penicillium chrysogenum)、灰黄青霉(Penicillium griseofulvum)等优势种分离出来, 还获得小刺青霉(Penicillium spinulosum)、瓶梗青霉(Paecilomyces Bainier)等海洋环境少见的种, 利用优势种研究对环境指示作用的研究正在进行中。

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(本文编辑: 张培新)

Culturable deuteromycetes diversity and PAHs contamination in Jiaozhou bay

JIANG Hui-chao1,2, TIAN Li1,2, SHI Zhen-ping1, ZHANG Jiu-ming1
(1. Qingdao University of Science & Technology, Qingdao 266042, China; 2.The First Institute of Oceanography, SOA, Qingdao 266061, China)

May,11,2012

Jiaozhou bay; PAHs; deuteromycetes

Five different kinds of culture medium were used to selectively isolate culturable Deuteromycetes in contaminated coast of Jiaozhou bay and 235 strains of Deuteromycetes were obtained. Among the medium, YM and MPDA isolated Deuteromycetes the best. The isolate rates of the total isolated-strains of YM and MPDA were 26.4% and 24.7%, respectively. PAHs contents among the three sampling sites manifested significant difference (P＜0.05) with the lowest in Shilaoren tidal zone (average 113.8ng/g), moderate in Haibo River estuary (average 324.9 ng/g) and the highest in Licun River estuary (average 882.1ng/g). On the basis of the changes of PAHs contents in different sites, with the increase of PAHs amount, the amount of culturable Deuteromycetes increased in certain degree and then decreased. Further research showed that the dominant species differed in the three sites with different PAHs contents which indicated PAHs contamination might exert effect on the composition of Deuteromycetes colony.

X55

A

1000-3096(2013)05-0033-06

2012-05-11 ;

2012-06-02

“十二五”国家科技支撑计划项目(2011BAE06B04); 国家863计划项目(2011AA10A202-2, 2011AA09070402); 海洋公益项目(201005032-2)

姜会超(1984-), 男, 山东青岛人, 硕士, 主要从事海洋微生物的研究, E-mail: jianghuichao2008@163.com; 田黎, 通信作者,电话:86-532-88967423, E-mail: wshw8@yahoo.com.cn