2，4-D、NAA对甘蔗胚性愈伤组织形成及分化的影响

姚丽，曾千春，杨昆，赵培方，吴才文

（1.云南省甘蔗遗传改良重点实验室/云南省农业科学院甘蔗研究所,开远661600；2.云南农业大学农学与生物技术学院,昆明650201）

2，4-D、NAA对甘蔗胚性愈伤组织形成及分化的影响

姚丽1，曾千春2，杨昆1，赵培方1，吴才文1

（1.云南省甘蔗遗传改良重点实验室/云南省农业科学院甘蔗研究所,开远661600；2.云南农业大学农学与生物技术学院,昆明650201）

以新台糖22（ROC22）、福农94-0403、云蔗03-258及P44为材料，MS为基本培养基，研究切割厚薄不同的外植体及2，4-D浓度对甘蔗愈伤组织诱导的影响，R1、R2及R3三种不同培养基对分化不定芽的影响。结果表明：①外植体切片0.1cm时的诱导率较切段0.5cm高；②切片时最适2，4-D浓度为1～2mg/L，而切段时则以3mg/L时诱导率达最大；③R2和R3分化效果优于R1，R3分化培养基：MS+6-BA 1mg/L+NAA 1mg/L对愈伤组织分化不定芽的效果最佳。

甘蔗；组织培养；2，4-D；NAA

甘蔗（Saccharum spp.）是重要的糖料和能源作物。蔗糖约占世界食糖总产量的70%～80%,而在我国达90%以上[1]。甘蔗是无性繁殖作物,用种量大、繁殖倍数低,通过组织培养快繁技术能加快品种繁殖及推广速度。甘蔗也是第一个获得组织培养成功的禾本科植物,自1969年Babar和Nickell在斐济突破从甘蔗组织培养物中实现植株再生距今已有四十多年[2],甘蔗组织培养技术已广泛应用于健康种苗快繁及甘蔗遗传转化领域[3-6]。但是,对于遗传基础复杂的甘蔗而言,甘蔗愈伤组织的诱导、增殖和分化能力等组织培养特性受遗传调控,不同基因型再生效率存在较大差异[7-9]。而甘蔗胚性愈伤组织是良种快繁及遗传转化的关键及基础。因此,获得高质量的胚性愈伤组织,并使之大量分化成芽对健康种苗快繁及甘蔗基因工程育种具有深远意义。但是,大量甘蔗组织培养需要大量甘蔗茎梢之间的矛盾日益严重。传统大部分研究者把外植体切成0.25～0.5cm长的段来诱导[7-11],但是该法较浪费材料,也有把外植体切成0.1cm厚的小圆片来诱导[3,12-13]。但是这两种外植体类型所需的2,4-D浓度是否存在差异,它们之间有什么相关性未见报道。

笔者选用大面积种植的生产品种及潜力甘蔗品种作为研究材料,比较切割厚薄不同的外植体及不同2,4-D浓度对甘蔗愈伤组织诱导的影响,并添加不同浓度的6-BA、KT及NAA,比较不同激素组合对分化不定芽的影响,为今后甘蔗健康种苗快繁及遗传转化研究提供参考依据。

1 材料与方法

1.1植物材料

以新台糖22（ROC22）、福农94-0403、P44及云蔗03-258为研究材料。其中,ROC22为全国主栽品种, P44、福农94-0403及云蔗03-258为糖能兼用品种。

1.2方法

1.2.1 愈伤组织诱导取ROC22、P44、福农94-0403及云蔗03-258甘蔗幼嫩叶鞘未成熟心叶为外植体, 75%酒精擦拭表面切取片（0.1cm）、段（0.5cm）两种类型,接种到MS培养基,25℃暗培养,诱导胚性愈伤组织产生。诱导愈伤时2,4-D浓度设1、2、3、4mg/L 4个梯度,每处理30个切段或切片,每处理3次重复。诱导率（%）=出愈伤组织总块数/接入外植体总块数×100。

1.2.2 分化培养基比较以ROC22、94-0403为材料,比较R1、R2及R3三种分化培养基,R1：MS+6-BA 2mg/L+KT 1.5mg/L；R2：MS+6-BA 1mg/L+NAA 0.1mg/L；R3：MS+6-BA 1mg/L+NAA 1mg/L。蔗糖：30 g/L,琼脂：7 g/L；pH=5.8。每处理30块愈伤组织,3次重复,培养30d后观察统计,比较R1、R2及R3三种分化培养基分化芽数及生长情况。分化率（%）=分化出芽总块数/接入愈伤组织总块数×100。

1.2.3 数据处理运用SPSS13.0专业版分析软件进行方差分析,新复极差多重比较。

2 结果与分析

2.1影响愈伤组织诱导率的因素

愈伤组织诱导效果受切片与切段的影响,且品种间出现明显差异。厚薄不同的外植体类型及2,4-D浓度对甘蔗愈伤组织诱导率的影响,结果详见表1。

由表1可以看出,切片时ROC22、P44在2,4-D质量浓度为1mg/L时诱导率达最大值,分别是100%、92.86%,福农94-0403、云蔗03-258则在2,4-D浓度为2mg/L时诱导率达最大值,分别是100%、72.22%；而切段时,除福农94-0403在2,4-D质量浓度为2mg/L时诱导率达最大值外,ROC22、P44及云蔗03-258都在2,4-D浓度为3mg/L时诱导率达最大值,分别是90.91%、88.24%及76.00%。因此,切片时2,4-D的最佳浓度为1～2mg/L,而切段时最佳浓度则是3mg/L。

不同品种间诱导率有差异,平均诱导率由大到小的顺序是：福农94-0403＞P44＞ROC22＞云蔗03-258。除云蔗03-258外,切片时诱导率平均值皆在80%以上,而切段时诱导率平均值仅在70%左右。且经观察发现,切片时从第3d开始陆续在切口处出现细胞膨大体,而切段则要10d左右。因此,切片诱导较切段诱导更易在较短时间内出现胚性愈伤组织。总之,外植体切片诱导效果更好,2,4-D的最佳浓度为1～2mg/L。

2.2分化培养基的比较

愈伤组织分化效果受培养基和品种的影响,分化结果表现出明显的差异。以ROC22、福农94-0403为材料,在R1、R2及R3三种分化培养基中培养30d后观察统计,计算分化率,结果详见表2。

由表2可看出,校正模型（Corrected Model）是“品种”、“培养基”及“品种×培养基”对应值之和,F= 42.465,P=0.000＜0.01,差异极显著,表明所用模型有统计学意义。品种的F=136.743,P=0.000＜0.01,差异极显著；培养基的F=32.323,P=0.000＜0.01,差异极显著；品种与培养基互作的F=5.469,P=0.021＜0.01,差异显著。这说明不同品种和不同培养基对甘蔗的分化率均有极显著影响,且影响次序为品种＞培养基＞品种与培养基的互作。

由表3多重比较分析可知,愈伤组织在3种培养基中均能分化不定芽,但不同品种分化芽数差异较大。对于ROC22而言,培养基对分化率的影响依次是R3＞R1＞R2,但差异不显著；而对于福农94-0403,培养基对分化率的影响依次是R3＞R2＞R1,且差异极显著。2个甘蔗品种均以添加NAA的R3分化效果最好,添加KT的R1效果较差,尤以褐化严重的品种福农94-0403最为明显（图1）。说明6-BA+KT组合褐变较6-BA+NAA组合严重。此外,在相同激素组合与相同浓度下,ROC22的分化率均高于福农94-0403,说明分化率受品种遗传特性影响。总之,R3培养基为试验品种的最佳分化培养基。

表1 不同2,4-D浓度诱导率（%）的比较

表2 不同甘蔗品种、分化培养基对分化率的方差分析

表3 不同甘蔗品种、分化培养基的分化率(%)

图1 不同分化培养基的比较

3 讨论

3.1外植体类型及2，4-D浓度是影响甘蔗愈伤组织诱导率的重要因素

2,4-D是诱导甘蔗愈伤组织不可缺少的生长物质[14-16]。本研究比较了切割厚薄不同的两种外植体的诱导率,笔者发现,2,4-D使用浓度不仅因不同基因型而存在差异,而且外植体的厚薄也能影响诱导率,且外植体厚薄不同、使用的2,4-D浓度也随之不同。研究结果表明,外植体切成0.1cm厚的小圆片时,2,4-D浓度为1～2mg/L时诱导率达最大值,而切段则在3 mg/L时诱导率达最大。这可能是因为在相同大小的直径下,外植体切成0.1cm的片比切成0.5cm的段更接近培养基、体积更小、消耗更少,因此需要的2,4-D也较少。另外,笔者还发现,用0.1cm厚的小圆片不仅节约了材料及成本,而且诱导时间也较短、质量也较好。因此,供试品种以外植体切片、2,4-D浓度为1～2mg/L诱导愈伤组织效果最好。

3.2 NAA对甘蔗愈伤组织分化出苗的影响

不同激素混合使用更有利于降低分化苗的变异率[17]。曾东火等[10]认为细胞分裂素（KT、6-BA）与生长素（NAA、IBA）混合使用分化率高、苗多,而细胞分裂素则KT优于6-BA。但何明等（1988）[18]报道KT对于甘蔗几乎没有什么效果。而生长素则以NAA较好,因为NAA不仅有促进生根的作用,对于禾本科及某些单子叶植物而言,也有利于分化的作用[19]。贤武等（2000）[20]研究也表明,6-BA+KT组合褐变最严重,最轻的是6-BA和6-BA+NAA,且浓度越低褐变越轻。本研究试验也表明,6-BA+KT组合的R1褐变最严重,6-BA+NAA组合的R2次之、R3最轻,特别是褐化较严重的福农94-0403更明显。这可能是因为细胞分裂素类物质有刺激和增进甘蔗多酚氧化酶活性的作用,因而增加“酚-醌”类物质对细胞的毒害,这就解释了为什么含细胞分裂素相对较多的分化培养基褐化最严重,分化效果最差。研究结果表明：R3分化培养基对供试品种愈伤组织分化不定芽的效果最佳。

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Effects of 2,4-D and NAA on Embryogenic Callus Formation and Shoot Regeneration of Sugercane（Saccharum spp.）

YAO Li1,ZENG Qian-chun2,YANG Kun1,ZHAO Pei-fang1,WU Cai-wen1
（1.Yunnan Key Laboratory of Sugarcane Genetic Improvement/Sugarcane Research Institute,Yunnan Academy of Agricultural Sciences,Kaiyuan 661600,China;2.College of Agronomy and Biotechnology,Yunnan Agricultural University,Kunming 650201, China）

Explants of sugarcane varieties ROC22,Funong 94-0403,Yunzhe 03-358 and P44 were cultured on MS medium with various supplements.Experiments were executed to evaluate the effect of different thickness of explants and different concentration of 2,4-D on callus induction as well as three different medium of R1,R2, R3 on shoot regeneration.The results were as the following:firstly,the induction rate of explants of 0.1 cm thick discs was higher than that of 0.5 cm thick segments;secondly,the appropriate 2,4-D concentration for callus induction were 1-2 mg/L for explants of 0.1 cm thick and 3 mg/L for explants of 0.5 cm thick;thirdly,shoot regeneration rating ofthe R2 and R3 were better than thatofthe R1,and the R3 medium:MS supplemented with NAA at 1 mg/L and 6-BA at1 mg/L was the bestmedium for shootregeneration.

sugarcane;tissue culture;explantthickness;2,4-D;NAA

S566.1；Q78

：A

1007-2624（2013）02-0008-03

2013-01-27

国家现代农业产业技术体系建设专项资金（CARS-20-1-1）。

姚丽（1984-）,女,云南省金平县人,硕士,研究实习员,主要从事甘蔗遗传育种研究。

吴才文,研究员,主要从事甘蔗遗传育种研究。E-mail：gksky_wcw@163.com