HMGA2蛋白在肝胆管细胞癌及肝细胞癌组织中的表达及意义

袁 波 沈 杰 凌建新 周玉坤 蔡珍福

高迁移率蛋白A(high mobility group A，HMGA)是1种广泛参与细胞各种生理活动的蛋白质，主要生理功能包括可诱导性基因转录的调控、将反转录病毒整合到染色体上、诱导转化及促进癌细胞活化等［1，2］。其中HMGA2在恶性肿瘤发生、发展中的作用正成为癌症研究的一个热点问题［3～5］。目前关于HMGA2在肝内胆管细胞癌中的表达的相关性研究尚未见报道，因此我们应用免疫组织化学方法，检测HMGA2在肝内胆管细胞癌组织内的表达，以评估其在肝胆管细胞癌诊断中的价值，同时检测HMGA2在肝细胞癌组织中的表达，并与肝内胆管细胞癌组织进行比较，以探讨HMGA2在两者鉴别诊断中的价值。

1 材料与方法

1.1 一般资料

收集解放军第455医院2005～2012年间收治的、肝胆管细胞癌及肝细胞癌手术或肝穿刺活检标本各30例，病例均经病理检查证实。选取的病理切片均经有经验的病理科医生重新审核。依据2003版国际抗癌联盟(UICC)分期法进行分期。肝胆管细胞癌组均为胆管腺癌，男性12例，女性18例;年龄30～82岁，平均(55±13.6)岁;TNM分期:Ⅰ期3例，Ⅱ期6例，Ⅲ期16例，Ⅳ期5例。肝细胞癌组男性17例，女性13例;年龄35～72岁，平均(53.7±9.9)岁;TNM 分期:Ⅰ期5例，Ⅱ期8例，Ⅲ期13例，Ⅳ期4例。两组在性别、年龄及肿瘤分期上无统计学差异。另选取同期正常肝内胆管组织及肝组织各20例作为各自对照组。

1.2 试剂

鼠抗人HMGA2单克隆抗体购自英国Abcam公司，免疫组化试剂盒购自美国Dako公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫组化染色 每个蜡块取4 μm厚连续切片行免疫组化染色。按试剂盒说明书进行操作。先对组织切片进行常规脱蜡、水化，然后用3%H2O2去离子水孵育10 min，以阻断内源性过氧化物酶的干扰。EDTA(pH 8.0)修复液微波常规修复，待其自然冷却，1×PBS清洗后滴加100 μl鼠抗人HMGA2(1:100稀释)，4℃孵育过夜，然后用PBS冲洗，2 min×3次。滴加试剂盒中的试剂1，37℃孵育20 min，1×PBS冲洗，2 min×3次，然后滴加试剂盒中的试剂2，37℃孵育20～30 min，PBS冲洗，2 min×3次。最后DAB显色10 min，终止显色，苏木精复染，盐酸乙醇固定，封片并观察。以1×PBS代替一抗作为阴性对照。

1.3.2 结果判断 光学显微镜下观察组织标本的着色程度，从而判断免疫组化结果。HMGA2蛋白阳性表达主要表现为细胞核内有棕黄色或棕褐色颗粒。高倍镜下(×200)随机选8个视野，计数阳性细胞数:阳性细胞率≤5%为0分，5% ～25%为1分，26% ～50%为2分，51% ～75%为3分，＞75%为4分;同时根据染色强弱程度计分:无染色为0分，弱染色为1分，中等强度染色为2分，强染色为3分;根据上述两者分数之和判定最后结果:0分为(-)，1～2分为(+)，3～4分为(++)，5～6分为(+++)，7分为(++++)。统计分析时(-)为阴性，(+)和(++)合计为弱阳性表达，(+++)和(++++)合计为强阳性表达。以上结果均至少由2位病理医师采用双盲法观察并确定。

1.4 统计学处理

实验数据处理应用统计学软件SPSS 13.0(SPSS Inc.，U.S.A)做四格表的卡方检验。

2 结果

2.1 HMGA2在肝胆管细胞癌及正常胆管组织中的表达情况

HMGA2在肝胆管细胞癌组织中呈高表达(73.3%，22/30)，而在20例正常胆管上皮组织中仅有3例呈弱阳性表达(15.0%，3/20)，两者比较有非常显著性差异(P＜0.01)(表1)。

2.2 HMGA2在肝细胞癌及正常肝组织中的表达情况

HMGA2在肝细胞癌组织中阳性表达率为43.3%(13/30)，而在正常肝组织中阳性表达率为10.0%(2/20)，两者比较有显著性差异(P＜0.05)(表1)。

2.3 HMGA2在肝胆管细胞癌及肝细胞癌组织中的表达情况

HMGA2在肝胆管细胞癌组织中阳性表达率(73.3%)明显高于肝细胞癌组织(43.3%)，两者比较有显著性差异(P＜0.05)(表1)。

表1 4种组织中HMGA2表达情况(例)

3 讨论

肝内胆管癌的发病率呈逐年上升的趋势，其诊断多依赖于临床影像学检查，但往往发现时已处于中晚期，容易在肝内形成转移播散，失去根治机会，所以早期诊断较为困难。金晓凌等［6］应用凝集素点印迹法分析胆汁糖蛋白糖链结构，使胆管癌的诊断率有所提高。高迁移率族蛋白(high mobility group protein，HMG)是一系列染色质相关蛋白质，广泛存在于真核生物中，含量丰富，因其在聚丙烯酰胺凝胶电泳中具有较高的迁移能力而得名，HMG包括HMGA、HMGB和HMGN3个家族。HMGA家族由 HMGAla、HMGA1b、HMGA1c和HMGA2 4种蛋白质组成，前3种蛋白质由同一个基因编码，HMGA2由1个断裂基因编码。近年来大量研究发现，许多肿瘤的发生、发展均与HMGA2基因表达异常有关［3～5］。HMGA2在肝胆管细胞癌中的表达情况的研究，至今在国内外未见报道。在本研究中，我们应用免疫组织化学方法，检测HMGA2在肝内胆管癌及正常胆管组织中的表达，结果表明，HMGA2在肝内胆管癌组织中高表达(73.3%，22/30)，而在正常胆管组织中低表达(15.0%，3/20)，两者比较有显著性差异(P＜0.01)。提示HMGA2表达可能与肝内胆管细胞癌的发生有一定的关系，HMGA2可能成为肝内胆管细胞癌诊断的一个潜在分子标记物。同时，我们的研究表明，HMGA2在肝细胞癌的表达阳性率为43.3%，与正常肝组织表达阳性率(10.0%，2/20)相比，有显著性差异，与刘蓓等［7］的报道基本一致，亦证实了HMGA2在肝细胞癌诊断中的潜在价值。

肝细胞癌与肝胆管细胞癌均为肝脏原发恶性肿瘤，但因其组织病理学上的来源不同，故生物学特性亦各异。临床上常根据影像学的差异来进行鉴别。肝细胞癌与肝胆管细胞癌在螺旋CT增强动脉期、门静脉期以及延迟扫描期等各期增强的密度及强化特点均有比较大的差别，据此可以作为两者鉴别诊断的方法之一［8］。同时，有不少学者在努力寻找对两者的鉴别有益的分子标记物。Leong等［9］指出，Hep-1是肝细胞癌的敏感标志物，但在肝胆管细胞癌组织亦存在一定的表达阳性率。宗华等［10］进一步针对肝内胆管细胞癌及肝细胞癌的免疫组化差异进行统计对比，对810例肝内胆管癌患者与肝细胞癌患者癌组织比较后得出，Hep-1、CD10等指标在两者中表达有显著性差异。Abe等［11］研究表明，HMGA家族的成员之一:HMGA1在肝内胆管癌及肝转移癌中的表达率分别是40%及53.3%，而其在肝癌中几乎不表达，所以提出HMGA1有可能成为鉴别胆管癌及肝癌的潜在诊断标志物。HMGA1与HMGA2同属于HMGA家族成员，均作为转录调节因子，参与许多细胞功能，包括细胞周期的调控，细胞分化、老化以及肿瘤的转化等［12］。鉴于以上原因，我们尝试HMGA2在鉴别肝内胆管癌及肝癌中是否亦存在价值。我们的结果表明，HMGA2蛋白在肝细胞癌组织中表达阳性率为43.3%(13/30)，而HMGA2蛋白在肝胆管细胞癌中表达率为73.3%(22/30)，两者比较有显著性差异。HMGA2蛋白在肝细胞癌及肝胆管细胞癌组织中的表达差异，提示HMGA2亦可能在两者鉴别诊断方面，成为一个潜在的分子标志物。

综合对HMGA2在肝胆管细胞癌及肝细胞癌中表达情况的分析，提示HMGA2可能参与了上述2种癌症的发生发展。HMGA2在两者中高表达，而不表达于正常胆管组织及肝组织，提示其可能可以作为肝胆管细胞癌及肝细胞癌诊断的分子指标之一。HMGA2在肝胆管细胞癌组织中的表达明显强于肝细胞癌，两者比较有显著性差异，提示HMGA2可能作为肝胆管细胞癌及肝细胞癌的鉴别诊断的分子指标之一。

［1］Johnson KR，Cook SA，Davisson MT.Chromosomal localization of the murine gene and two related sequences encoding high-mobility-group I and Y proteins〔J〕.Genomics，1992，12(3):503.

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