子宫内膜癌患者血清的蛋白质组学研究

陈锋菊 宁丽红

（1.湖南科技大学 生命科学学院, 湖南 湘潭 411201; 2.湖南第一师范学院 教育科学系, 湖南 长沙 410205）

子宫内膜癌（Endometrial Carcinoma，EC） 又称子宫体癌，是由子宫内膜腺体上皮组织发生的恶性肿瘤，为女性生殖器常见的三大恶性肿瘤之一。近年来，全球每年有约142000 女性患上此病，约42000 女性死于此病；其发病率呈直线上升，已接近甚至超过宫颈癌，且患者具有年轻化趋势[1]。

目前，国内外对子宫内膜癌的研究主要集中于采用免疫组化等技术，检测相应物质在子宫内膜癌组织中的表达及临床意义[2-5]。而有关子宫内膜癌发生的分子生物学机理和发展机制的研究鲜见报道。Liotta 等[6]报导，通过蛋白质组学分析技术可以研究肿瘤早期的遗传学变化，从而寻找到疾病早期可能的蛋白质标志物。而血清在临床上容易获取并便于检测，一直是筛选疾病诊断标记物的最佳研究对象。通过肿瘤患者的血清蛋白质组学研究，已经初步发现了一些肿瘤相关蛋白质[7-12]。因此，本研究将通过血清蛋白质组学研究技术，寻找和鉴定子宫内膜癌相关蛋白质，试图为子宫内膜癌的早期诊断和治疗提供新方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 血清样品

2011 年10 月在湖南省肿瘤医院住院的子宫内膜癌患者6 例（平均年龄56 岁）；同时期的女性体检健康者6 例（平均年龄53 岁）。分别取清晨空腹静脉血3 ml，迅速置于4 ℃静置3 小时，3000 r/min 离心5 分钟，提取上清液，再将上清液静置5 分钟，15000 r/min 离心30 分钟，去掉白色絮状沉淀，留上层血清。分正常组和患者组，将获得的血清分别混合，以便消除个体差异。冰上分装，每EP 管100ul，并于-80℃冻存备用，避免反复冻融。

1.1.2 主要试剂

固相pH梯度（IPG）胶条（pH3-10NL，18cm）、载体两性电解质购自Bio-Rad公司；丙烯酰胺(Acr)、N,N′甲叉双丙烯酰胺(Bis)、十二烷基磺酸钠(SDS)、过硫酸铵(AP)、四甲基乙二胺(TEMED)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、甘氨酸(Gly)、二硫苏糖醇（DTT）、3-[ 3-(胆酰氨丙基) 二甲铵基]丙磺酸内盐(CHAPS)、碘乙酰胺( IAA) 、琼脂糖、尿素、乙腈、矿物油、甘油购自上海生工生物工程有限公司；考马斯亮蓝R-250、牛血清白蛋白(BSA)为Sigma公司产品；低分子量标准为上海伯奥生物制品公司。

1.1.3 主要仪器

IPG等电聚焦仪、垂直平板电泳槽购自Amersham Biosciences公司；扫描仪购自清华紫光总公司；PDQuest 分析软件购自BIO-RAD公司。

1.2 方法

1.2.1 血清样品的处理 冻融血清，4℃ 12000 r/min 离心5 min，取上清液0.5 mL 与0.5mL 乙腈混合(构成1 倍体积倍数的乙腈)，混合后，立即震荡混匀约15 s，置于摇床20 min( 60 转，20℃ )然后于4℃ 12 000 r/ min 离心10 min，最后取600 uL 上清液浓缩至 100 uL。

1.2.2 血清蛋白含量测定 蛋白质含量测定采用bradford 法[13]。

1.2.3 双向凝胶电泳及染色 取处理过的子宫内膜癌患者血清样品和健康者血清样品进行双向凝胶电泳。操作步骤参照IPG 使用指南。电泳完成后，对所得凝胶进行考染。

1.2.4 图像分析 用清华紫光扫描仪扫描2-DE 胶，PDQuest 软件对图像进行比较、分析，以确定差异蛋白质点。

2 结果

2.1 高丰度蛋白的去除

在样品处理时，根据本实验室之前在对去除子宫内膜癌血清高丰度蛋白的比较研究中得出的结论，采用1倍体积的乙腈对样品进行预处理,SDS-PAGE 后,考马斯亮蓝R-250 染色，结果见图1。结果表明，1倍体积的乙腈能有效去除血清中的绝大部分高、中丰度蛋白，同时保留较多的小分子量蛋白。

图1 子宫内膜癌血清样品SDS-PAGE 电泳图

2.2 2-DE 图谱分析

本研究采用pH 3-10 的胶条和12 %的分离胶对子宫内膜癌患者血清和健康者血清进行双向电泳，考马斯亮蓝R-250染色后，得到了子宫内膜癌患者与健康者血清蛋白的2-DE图谱。

PDQuest 软件分析图谱发现，两组的差异蛋白质点（表达量相差2倍及以上）共15个，相对于健康组，子宫内膜癌患者组表达量下调的蛋白质点2个，表达量上调的蛋白质点11个，在健康组缺失而只在患者组表达的蛋白质点2个，具体差异点见图2。图3是部分差异蛋白的局部放大图。

图2 子宫内膜癌患者和健康者血清蛋白双向电泳图谱

图3 部分差异蛋白的局部放大图

3 讨论

目前大于80%的子宫内膜癌患者诊断时为早期, 预后较好, 而晚期子宫内膜癌治疗困难, 预后较差[14-15]。因此，子宫内膜癌的早期诊断尤为重要。其诊断除传统的诊断性刮宫外, 还包括子宫内膜活检、宫腔镜检查、宫颈管和宫腔毛刷等。由此可见，子宫内膜癌一直以来缺乏一种简单、准确、损伤性小的诊断方法。因此有必要找到一种简单、准确而又无创性的诊断手段，以减少患者的身心痛苦。本研究通过抽取患者的外周静脉血获得血清后进行检测, 相对于检测其他组织对患者的创伤性要小很多, 操作也相对简单, 更经济、实惠、可行。

人血清中含有成千上万种的蛋白质，各种蛋白质的含量差异很大。而生物标志物往往是在某些疾病的病理过程中分泌入血的一些低分子量蛋白。这些低分子量蛋白的含量相当少，极易被高丰度蛋白所掩盖和干扰。本实验采用1倍体积的乙腈对样品进行了沉淀处理， 电泳结果显示，经预处理去除高丰度蛋白后，血清样品中的低分子量蛋白得到了较好的保留和分离。

目前，蛋白质组学技术在子宫内膜癌血清中的应用还少有报道。本实验通过双向电泳技术，获得了较清晰的子宫内膜癌患者血清的2-DE 图谱。图谱软件分析发现，相对于健康组，子宫内膜癌患者组表达量下调的蛋白质点有2个，表达量上调的蛋白质点有11个。其下调的蛋白质有可能是一些对肿瘤生长或转移起到调节作用的蛋白质，或者是某些抑癌基因作用的结果。而上调的蛋白质以及只在患者组表达的蛋白质有可能是肿瘤细胞分泌、释放的蛋白质，或者是由于癌细胞影响而引起的其他组织器官异常分泌的蛋白质。这些差异蛋白有可能是子宫内膜癌病理过程中的重要蛋白，也有可能是子宫内膜癌的标志性蛋白。进一步的质谱鉴定可以明确这些蛋白质的种类及其功能，为进一步认识子宫内膜癌的病理机制奠定了基础，最终有可能应用于子宫内膜癌的临床诊断及治疗等方面。

[1] Amant F,Moerman P,Neven P,et al.Endometrial cancer[J].Lancet, 2005,366(9484):491-505.

[2]Saito M,Sato Y,Watanabe J, et al.Angiogenic factors in normal endometrium and endometrial adenocarcinoma[J].Pathol lnt,2007,57(3):140-147.

[3]朱正鹏, 贾国凤, 马健波等.子宫内膜腺癌C-erbB-2 COX-2 过度表达的相关性分析[J].中国临床肿瘤,2008,35(11):633-635.

[4]Tashiroll H,Blazes M S,Wu R,et al.Mutations in PTEN are frequent in endometrial carcinoma but rare in other common gynecological malignancies[J].Cancer Res,1997,57(18):3935-3940.

[5]Kanamori Y,Kigawa J,Itamochi H,et al.Correlation between loss of PTEN expression and Akt phosphorylation in endometrial cancinoma[J].Clin Cancer Res,2001,7:892-895.

[6]Liotta L A, Kohn E C.The microenvironment of the tumour-hostinterface [J].Nature,2001,411(6835): 375-379.

[7]Zhu W, Wang X N, Ma Y M, et al.Detection of cancer specific markers amid massive mass spectral data[J].Proc Natl Acad Sci USA,2003,100 (25):14666-14671.

[8]Watkins B, Szaro R, Ball S, et a1.Detection of early-stage cancer by serum protein analysis[J].Am Lab,2001,73: 32-36.

[9]Xiao X,Liu D,Tang Y,et al.Development of proteomic patterns for detecting lung cancer[J].Dis Markers,2004, 19(1):33-39.

[10]Cho W C, Yip T T, Yip C, et al.Identification of serum amyloid a protein as a potentially useful biomarker to monitor relapse of nasopharyngeal cancer by serum proteomic profiling[J].Clin Cancer Res,2004,10(1):43-52.

[11]Steel L F, Shumpert D, Trotter M, et al.A strategy for the comparative analysis of serum proteomes for the discovery of biomarkers for hepatocellular carcinoma[J].Proteomics,2003,3(5):601-609.

[12]李萃,肖志强,章晓鹏,等.人肺鳞癌组织的血清蛋白质组学的比较分析[J].中国生物化学与分子生物学报,2005,21(3):357-368.

[13]陈钧辉,陶力,李俊,等.生物化学实验[M].科学出版社,2007:110-116.

[14]Bristow R E, Zerbe M J, Rosensh ein N B, et al. Stage IVB endometrial carcinoma: T he role of cyt- oreductive surgery and determinants of survival [J].Gynecol Oncol,2000,78( 9) :85- 91.

[15]Ayhan A,Taskiran C,Celik C,et al . The inf luence of cytoreductive surgery on survival and morbidit y in stage IVB endometrial cancer[J].Int J Gynecol Cancer 2002,12( 5) :448- 453.