红菜苔废弃物中多酚的超声波水提工艺优化

代立婷，李 娅，何玲玲，唐文娟，刘超立，李建华

（特色果蔬质量安全控制湖北省重点实验室，湖北工程学院，湖北孝感432000）

红菜苔（Brassica campestris L.var.purpurea Baileysh）又名洪山菜苔，俗称油菜苔。是十字花科芸苔属芸苔种白菜亚种的变种，也是原产中国的特产蔬菜，武汉、长沙、成都是其三个原产中心[1]，红菜苔以花苔供食，营养价值较高，含有钙、磷、铁、胡萝卜、素核黄素、尼克酸、抗坏血酸等成分，为蔬菜中的佳品，但其茎皮含纤维素较多，可食性差，在食用前通常被人们剥下丢弃。植物多酚（p lant polyphenol）是自然界中分布广泛的植物次生代谢产物[2]，是一类分子结构中有若干个酚性羟基的物质的总称，包括茶多酚、黄酮类、原花青素等。多酚类化合物具有抗氧化[3]、抗紫外辐射[4]、改善微循环[5]等功能，在医药、食品和饲料等领域均有一定的应用前景，提取植物多酚是当前的一个热点。常用的多酚提取方法多以有机溶剂作为提取剂，辅以加热回流、超声、微波等。由于作为提取剂的乙醇、甲醇和丙酮等有一定毒性且在后续工序中很难完全去掉，同时也增加了生产成本，因此不适宜食品及医药工业用多酚的生产[6]。使用水作为溶剂提取植物多酚等活性物质，可避免有机物在产品中的残留及对环境的污染[7]；超声波产生的空化、振动、粉碎、搅拌等综合效应可破坏细胞壁，增加溶剂穿透力，提高植物多酚等活性物质的提取率和缩短提取时间[8]，而且应用超声波提取细胞内容物，不会对提取物的结构、活性产生影响[9]。本研究以水为溶剂，结合超声波这一辅助手段，探讨超声波功率、液料比和提取时间对红菜苔废弃物多酚提取的影响，对充分利用农业废弃物资源，高效无污染地提取红菜苔废弃物多酚具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

红菜苔 产自湖北省孝感市，采摘新鲜红菜苔，将剥取的茎皮在40℃烘箱中干燥至手捏即碎后粉碎过60目筛备用；没食子酸 天津市红岩化学试剂厂；Folin-Ciocalteau试剂 自制，磷钼钨酸-碳酸钠显色体系；蒸馏水、碳酸钠 上海联试化工试剂有限公司。

Cary 60型紫外可见分光光度计 安捷伦科技（中国）有限公司；202-2型干燥箱 上海市实验仪器总厂；PL203型电子天平 梅特勒-托利多仪器上海有限公司；H-4型数显恒温水浴锅 江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；康佳BCD-138UTS型冰箱 安徽康佳电器有限公司；DL-480D型智能超声波清洗器 上海之信仪器有限公司；100～1000μL微量移液器。

1.2 实验方法

1.2.1 Folin-Ciocalteau法的比色条件优化 以没食子酸溶液作为标准品，确定用Folin-Ciocalteau法[10]在本实验室条件下检测红菜苔多酚含量的最优条件：取50μg/m L的没食子酸溶液，在500～900nm的波长下进行波谱扫描，确定检测波长；各取1m L 50μg/m L没食子酸溶液置于10支试管中，分别加入1m L浓度为10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%的Folin-Ciocalteau试剂，再各加入3.0m L 7.5% Na2CO3，蒸馏水定容至10m L，20℃避光静置1h，在前述确定的波长下测定吸光度值，确定Folin-Ciocalteau试剂浓度；在前述优化条件下，在浓度在5%～15%之间均匀设置5个Na2CO3试剂浓度梯度进行实验，确定最佳Na2CO3浓度；在前面已确定的条件下，分别在避光和不避光的条件下进行静置显色反应1h，确定静置时是否需要避光；在前述优化条件下，反应温度在15～45℃均匀设置4个梯度、显色时间从10～90m in均匀设置5个梯度，全组合设计，确定最佳显色时间和最佳反应温度。

1.2.2 标准曲线回归方程 以没食子酸溶液作为标准品，配制浓度分别为0、10、20、30、40、50、60、80、100μg/m L没食子酸溶液，分别取0.5m L标准液于20m L刻度试管中，采用上述已优化的Folin-Ciocalteau法比色条件，测定吸光度值。以标准品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，求标准曲线回归方程。

1.2.3 超声波水提法提取多酚的单因素实验 先后在液料比为40∶1、提取时间为15m in的条件下，将超声波功率设置为0、96、192、288、384、480W 6个梯度；在超声波功率为192W、提取时间为15m in的条件下，将液料比均匀设置为30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1（m L/g）共5个梯度；在超声波功率为192W、液料比为40∶1的条件下，将提取时间设置为5、10、15、20、25min 5个梯度，来分别确定进行响应曲面分析时超声波功率、料液比和提取时间的取值范围。

1.2.4 响应曲面实验设计 为研究超声波功率、料液比以及提取时间对多酚提取的互作效应，用Design-Expert软件中的中心复合设计（Central composite design，CCD）模块中的旋转回归设计进行实验设计，设计了一组3因素5水平的共计20次的实验（full CCD设计）以进行响应曲面分析，实验设计的因素及水平编码见表1。

表1 中心组合设计因素水平表Table1 Central composite design factors levels table

1.2.5 红菜苔废弃物多酚的提取与检测 采摘新鲜红菜，将剥取的茎皮在40℃烘箱中干燥至手捏即碎后粉碎过60目筛，准确称取0.5g于烧杯中，按照中心组合设计实验中设置的不同提取条件分别进行浸提，抽滤后收集各个提取条件下得到的提取液，用优化了的检测条件进行检测并换算成每克干燥红菜苔茎皮中多酚的含量（mg/g，以没食子酸的重量计）。

2 结果与讨论

2.1 Folin-Ciocalteau法比色条件的优化及标准曲线方程

经优化，确定Folin-Ciocalteau法检测多酚的波长为768nm；Folin-Ciocalteau试剂浓度为50%，确定Na2CO3最佳浓度为7.5%，可不避光静置，最佳显色时间为30min，最佳反应温度为45℃。

以没食子酸溶液作为标准品，在上述优化条件下得标准曲线回归方程为y=0.0155x+0.0611，其中y为吸光值，x为没食子酸溶液的浓度（μg/m L），该回归方程的线性决定系数R2=O.9954。

2.2 单因素实验结果

2.2.1 超声波功率对红菜苔废弃物多酚提取的影响

图1 超声波功率对红菜苔废弃物多酚提取的影响Fig.1 Effectof ultrasonicon yield of polyphenols from Brassica campestris L.var.purpurea Baileysh waste

由图1可以看出，随着超声波功率增加，红菜苔废弃物多酚的提取量也增加，到192W时达到最大值，超声波功率大于192W时，随着功率的增加，红菜苔废弃物多酚的提取量先明显下降，然后缓慢升高。这表明超声波功率过低和过高都不利于红菜苔废弃物多酚的提取，因此在响应曲面设计中选取192W为中点，在96～288W范围内研究超声波与其他两因素的互作效应。

2.2.2 液料比对红菜苔废弃物多酚提取的影响 由图2可知，当液料比为40∶1时，红菜苔废弃物多酚的提取量升到比较高的水平，随着液料比的进一步增加，红菜苔废弃物多酚的提取量先略微下降，再缓慢上升，考虑到液料比越高，后续浓缩成本也越大，因此本研究选取液料比40∶1为中心点，分别以20∶1和60∶1为下限和上限，研究液料比与其他两因素的互作效应。

图2 液料比对红菜苔废弃物多酚提取的影响Fig.2 Effectof liquid-solid ration on yield of polyphenols from Brassica campestris L.var.purpurea Baileysh waste

2.2.3 提取时间对红菜苔废弃物多酚提取的影响 由图3可以看出，随着提取时间的增加，红菜苔废弃物多酚的提取量总体上呈增加趋势，但从提取时间20m in开始，增幅十分缓慢，考虑到从理论上讲，在一定范围内，提取时间越长，红菜苔废弃物多酚的提取量应该越高，本研究以提取时间25min为中心点，在10～40m in范围内研究提取时间与其他两因素的互作效应。

图3 提取时间对红菜苔废弃物多酚提取的影响Fig.3 Effectof time on yield of polyphenols from Brassica campestris L.var.purpurea Baileysh waste

2.3 超声波提取红菜苔多酚的响应曲面实验设计及提取的结果

在单因素实验的基础上，以超声功率A（W）、液料比B（m L∶g）、提取时间C（m in）为参数，以红菜苔提取液中多酚含量Y（mg/g，以没食子酸的重量计）为指标，进行响应曲面实验设计及提取的结果如表2所示。

表2 响应面实验设计与结果Table2 Design and results of response surface analysis

2.4 回归模型的建立及方差分析

通过Design-Expert软件对表中数据进行多元回归拟合及对模型进行方差分析，得到方差分析表（表3）以及如下回归方程，响应值Y为红菜苔中多酚的提取量为（mg/g）：Y=4.34-5.371×10-3A+0.30B+0.080C+0.24AB-0.090AC-0.085BC+0.23A2+0.21ABC+0.47AB2。

该回归方程的F值为8.19，p=0.0035＜0.01，说明回归模型是极显著的，该模型是有意义的；失拟项F= 0.084，p=0.9898＞0.05，表明失拟项差异不显著，即回归方程对所有的实验点拟合的较好，不存在其他对结果产生显著影响的未知因素；相关系数R2=0.9021，表明此模型拟合程度良好，响应值变化中的有90.21%可以用所选变量来解释，因此，该回归方程能很好地描述并预测各因素与响应值之间的关系。

2.5 响应曲面交互作用分析

采用多元三次回归方程来拟合影响因素与响应值之间的函数关系，分析上述方程所代表的响应曲面。根据三次方程模型做出超声功率和液料比之间交互作用的3-D响应曲面。从图4可以看出，液料比的曲面起伏较大，功率曲面较平缓，等高线沿液料比轴向较功率轴向密集，说明液料比对多酚提取量的影响比功率的影响大[11]，这与表3中方差分析的结论一致；图4呈不规则的马鞍形，最高点不在曲面中央，显示在研究所设定的范围内，随着液料比和超声波功率的增加，红菜苔废弃物多酚的提取量也逐渐增加。

表3 回归模型的方差分析表Table3 The variance analysis of regressionmodel

图4 液料比和超声波功率对多酚提取率的影响Fig.4 Influence of liquid-solid ratio and ultrasonic powe to extraction rate of polyphenol

2.6 参数优化与验证

通过Design Expert软件中的优化（optim ization）模块，在上述方程基础上，以红菜苔多酚提取率最高为优化目的，得到理论上提取红菜苔多酚的最优条件：超声波功率249W，液料比52∶1，提取时间34m in。在此条件下红菜苔多酚的理论提取量是5.69mg/g。为检验优化条件的可靠性，按照上述优化过的工艺参数，重复实验6次，实际测得红菜苔多酚平均提取量为5.84mg/g，与理论预测值相比，预测准确率为97.34%，预测值与实际验证值基本相符，表明该优化提取工艺稳定可靠。

3 结论

多酚是极性物质，可直接使用蒸馏水作为提取剂。利用超声波破碎红菜苔茎皮细胞，通过响应曲面法的优化实验得到提取红菜苔多酚水提的最优条件为：超声波功率249W，液料比52∶1，提取时间34m in。在此条件下，测得红菜苔多酚提取量为5.84mg/g，达到理论预测值的97.34%。采用优化的提取工艺参数提取红菜苔多酚，得率较高，能充分利用红菜苔废弃物，且用水作为溶剂，避免了提取过程中其他药物对产品的污染，具有很大的应用前景。

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