微波辅助提取蚕豆种皮中总黄酮的条件优化

冯学花，张国升，陶阿丽，曹殿洁

（安徽新华学院药学院，安徽合肥230088）

蚕豆为豆科植物蚕豆Vicia faba L.的种子，又称胡豆、佛豆、川豆、倭豆、罗汉豆，亦食亦药，蚕豆种皮即为蚕豆的种皮，为粮食、蔬菜和饲料、绿肥兼用作物，其种植以四川最多，其次为云南、安徽、浙江、青海等省[1]。蚕豆种皮具有健脾利湿的功效，《本草从新》称其能“补中益气，涩精，实肠”。文献报道在蚕豆种皮中含有多种对人体有益的生理活性成分，即所谓的植物化学成分，如黄酮类物质、原花青素、活性蛋白、活性肽及巢菜碱苷等。现代研究表明黄酮具有降血压、降血脂、扩张冠状动脉等作用[2]。

与传统溶剂提取法相比，微波提取技术具有：作用时间短、速度快、提取效率高、节能等显著特点[3]。目前，国内对于蚕豆种皮提取物的研究主要集中在原花青素的提取方面而对黄酮的研究较少。本文对蚕豆种皮总黄酮提取条件进行研究，利用单因素实验和响应面设计相结合的方法对蚕豆种皮总黄酮提取条件进行优化，为提高蚕豆皮的附加值，进一步研究开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

蚕豆 采自合肥市西郊（经安徽新华学院药物研究所鉴定为豆科植物蚕豆Vicia faba L.的种子），剥取种皮，置烘箱中，在60℃条件下干燥24h后用粉碎机粉碎过40目筛，所得粉末用棕色广口瓶收集，密封备用；芦丁标准品 合肥博美生物科技有限责任公司；无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、三氯化铁、三氯化铝、浓氨水 分析纯。

LD-1000型中药粉碎机 长沙市常宏制药机械设备厂；756型紫外可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司；G80F20CN2L-B8（R0）型Galanz/格兰仕微波炉 广东格兰仕电器有限公司；RE-2000型旋转蒸发器 上海洪旋实验仪器有限公司；PHS-3C型雷磁酸度计（pH计） 上海精密科学仪器有限公司；循环水式真空泵 河南巩义市英峪仪器厂；AL204-IC型电子天平 瑞士梅特勒-托利多仪器（中国）有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 芦丁标准曲线的制备 精密称取在120℃减压干燥至恒重的芦丁对照品100mg，置100m L量瓶中，加甲醇70m L，置水浴上微热使溶解，放冷，加甲醇至刻度，摇匀。精密吸取10m L，置100m L量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得标准溶液（每1m L中含无水芦丁0.1mg）[4]。精密量取芦丁标准溶液（0.1mg/m L）0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0m L，分别置于10m L量瓶中，各加30%乙醇至5.0m L，各精密加入5%亚硝酸钠溶液0.3m L，充分摇匀，放置6m in。各精密加入10%硝酸铝溶液0.3m L，充分摇匀，放置6m in。各加1mol/L氢氧化钠溶液4.0m L，用蒸馏水稀释至刻度，充分摇匀，放置15m in，用紫外可见分光光度法，在510nm波长处测定吸光度，以溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线[5]。

1.2.2 总黄酮的微波辅助提取 精确秤取10.0g蚕豆种皮粉末置于磨口三角瓶中，选取液料比、提取时间、提取功率三个因素，在不同条件下进行微波提取。提取后立即冰浴冷却，抽滤，吸取适量提取液测定黄酮含量，按照制作标准曲线的方法，测定吸光值，按照下式计算产率[6]。

总黄酮产率（%）=提取液中黄酮质量（g）/蚕豆种皮干粉末质量（g）×100

1.2.3 单因素实验方法 以蚕豆种皮为原料，利用微波萃取法研究乙醇浓度、微波提取时间、微波功率及液料比对蚕豆种皮总黄酮产率的影响。

1.2.3.1 微波功率的选择 取上述经干燥粉粹后的蚕豆种皮适量，加70%乙醇25倍量，分别在200、300、400、500、600、700W不同的微波功率条件下，萃取40s，考察不同微波功率对蚕豆种皮总黄酮产率的影响。

1.2.3.2 提取时间的选择 取上述经干燥粉粹后的蚕豆种皮适量，加70%乙醇25倍量，分别在500W微波功率条件下萃取10、20、30、40、50、60s时间，考察不同提取时间对蚕豆种皮中总黄酮产率的影响。

1.2.3.3 液料比的选择 取上述经干燥粉粹后的蚕豆种皮适量，分别加10、15、20、25、30、35倍量的70%乙醇在500W微波功率条件下，萃取40s，考察不同液料比对蚕豆种皮总黄酮产率的影响。

1.2.3.4 乙醇浓度的选择 取上述经干燥粉粹后的蚕豆种皮适量，分别加40%、55%、70%、85%、95%乙醇25倍量，在500W微波功率条件下进行微波提取，考察不同乙醇浓度对蚕豆种皮总黄酮产率的影响。

1.2.4 Box-Benhnken实验设计 通过单因素实验确定主要的影响因素及各因素的适当范围，依据Box-Benhnken的中心组合实验原理，采用响应面分析法，以液料比、微波功率和提取时间三个因素为自变量，以蚕豆种皮总黄酮产率为因变量，应用Design-Expert 8.0.5软件，采用三因素三水平实验，分析因素与水平见表1。

表1 因素水平表Table1 Table of factors and levels

2 结果与讨论

2.1 线性回归方程

根据各浓度芦丁标准溶液对应的吸光度，计算得到线性相关系数R2=0.9994，回归方程为A＝13.297C-0.0371。

2.2 单因素实验

2.2.1 微波功率对提取效果的影响 不同微波功率对蚕豆种皮中总黄酮产率的影响见图1。

图1 微波功率对总黄酮产率的影响Fig.1 Effect ofmicrowave power ethanol concentration on the yield of total flavonoid

由图1可知，黄酮产率随微波功率的增大先上升后下降，当微波功率为500W时，其产率最佳。继续增大功率时，产率降低，这是因为功率过大，溶液中的水分子振动剧烈，温度急剧升高，溶剂挥发太快，而且强热效应易破坏黄酮，导致产率下降[6-7]。

2.2.2 提取时间对提取效果的影响 不同提取时间对蚕豆种皮中总黄酮产率的影响见图2。

图2 提取时间对总黄酮产率的影响Fig.2 Effectofand extraction time on the yield of total flavonoid

由图2可知，随着时间的增加，黄酮产率先增加后降低，40s时的产率最高，为0.39%。可能是长时间后微波的强热效应造成黄酮部分分解及且溶剂蒸发导致黄酮溶出减少[8]。

2.2.3 液料比对提取效果的影响 不同液料比对蚕豆种皮中总黄酮产率的影响见图3。

由图3可见，随着液料比的增加，总黄酮产率增加。当液料比达到25∶1时，产率最高为0.49%，此后液料比增加，总黄酮产率下降，可能由于溶剂用量太大，会使热负荷增大，提取完全所需要的时间增加，使所提取溶液中黄酮浓度降低。

2.2.4 乙醇浓度对提取效果的影响 不同乙醇浓度对蚕豆种皮总黄酮产率的影响见图4。

从图4可知，乙醇浓度在40%～70%范围内，黄酮产率随乙醇浓度的增大而增加，乙醇浓度大于70%以后，黄酮产率随着乙醇浓度增大而下降，这是由于黄酮类是一类极性范围较广的化合物，在70%的乙醇溶液中，黄酮类物质能够最大限度地溶出，而当乙醇浓度增大时，水溶性黄酮溶出量开始减少，而出现黄酮的产率下降[4]。

图3 不同料液比对总黄酮产率的影响Fig.3 Effect of liquid-solid ratio on the yield of total flavonoid

图4 乙醇浓度对总黄酮产率的影响Fig.4 Effect of ethanol concentration on the yield of total flavonoid

2.3 响应面实验设计结果

实验设计与实验结果及分析见表2、表3。

由方差分析表3可知，回归模型高度显著（p＜0.0001），失拟项不显著（p=0.1371＞0.05）以及R2= 0.7767和Adeq Precision=19.549，远大于4，可知回归方程拟合度和可信度均很高，能够很好地对黄酮产率进行预测。由回归模型系数显著性检验结果可知，模型的一次项A（p=0.0011＜0.01），一次项B（p＜0.0001）对黄酮提取的线性效应极显著，而提取时间对产率没有显著影响（p=0.0598＞0.05）；二次项B2（p＜0.0001）对黄酮提取的曲面效应极显著，而A2（p=0.1416＞0.05）、C2（p=0.3480＞0.05）均不显著；交互项BC（p=0.0007＜0.01）极显著，AB、AC不显著；表明各影响因素对黄酮产率的影响不是简单的线性关系[4，9]。由模型拟合得到的回归方程为：Y=0.51+0.032A-0.0049B+0.014C+0.013AB-0.0017AC-0.005BC-0.014A2-0.12B2+0.0085C2。

表2 实验设计与实验结果Table2 Results of composite design

2.4 条件优化与预测

表3 方差分析表Table3 Analysis of variance

各因素对黄酮产率的响应面图见图5～图7。应用Design-Expert 8.0.5软件求导可得，当液料比为26.83∶1（m L/g）、微波功率为461.3W、提取时间为50s时，响应值（产率）预测的最大值0.5521%[6，10-11]。

图5 料液比与微波功率对提取产率的响应曲面图Fig.5 Three-dimensional response surface graph of liquid-solid ratio，microwave power for extraction yield

图6 料液比与提取时间对提取产率的响应曲面图Fig.6 Three-dimensional response surface graph of solid-liquid ratio，extraction time for extraction yield

图7 微波功率与提取时间对提取产率的响应曲面图Fig.7 Three-dimensional response surface graph ofmicrowave power，extraction time for extraction yield

2.5 验证实验

根据二次回归的数学模型分析结果，最优条件为液料比为26.83∶1（m L/g）、微波功率为461.3W、提取时间为50s时，响应值（产率）预测的最大值为0.5521%。考虑到实际操作性，对响应面二次回归所得最佳条件进行修正，确定蚕豆种皮的最佳提取条件为：液料比为27∶1（m L/g）、微波功率为460W、提取时间为50s。为了验证响应面法的可行性，根据上述修正后条件，再平行提取蚕豆种皮3份，测定总黄酮平均值为0.5469%，将所得实测值与二项式拟合方程预测的最大值进行比较，计算偏差，结果平均偏差为0.94%，偏差较小，说明该模型有效。

3 结论

通过单因素与响应面优化实验，确定了蚕豆种皮总黄酮提取的优化工艺条件为：液料比为27∶1（m L/g）、微波功率为460W、提取时间为50s。在此工艺条件下响应值（产率）预测的最大值为0.5521%，实验验证值为0.5469%，偏差较小，因此响应面设计的结果较为准确可靠，可用于微波辅助提取蚕豆种皮总黄酮工艺条件的优化和预测。

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