鱿鱼内脏水解液美拉德反应条件优化及反应前后氨基酸组成的变化

张慧芳，李婷婷，励建荣，*，李学鹏，董志俭

（1.渤海大学食品科学研究院，辽宁省食品安全重点实验室，辽宁锦州121013；2.大连民族学院生命科学学院，辽宁大连116600）

随着水产品加工业的快速发展，不同种类的鱿鱼产品不断涌现，由此而产生大量的加工下脚料，其中鱿鱼内脏约占15.92%[1]。这类副产物大都用来加工鱼粉，还有部分甚至被当作废物随意丢弃或掩埋。鱿鱼内脏营养丰富，每100g鱿鱼内脏中含脂肪21.15g，蛋白质21.24g，钙51.46mg，铁609.07μg和磷95.88μg[1]。此外，鱿鱼内脏水解液中还含有18种氨基酸（包括全部人体必需氨基酸），鱿鱼内脏油脂脂肪酸中含10.58%的EPA和15.23%的DHA，非常值得开发研究[2]。目前利用鱿鱼内脏提取鱼油、生产海味素、加工鱿鱼酱油等已有报道[3-6]。

美拉德反应在食品加工过程中可以使本来不具备颜色和香味的物质通过混合反应产生不同程度的褐色和香味。近年来的研究发现美拉德反应产物具有抗氧化作用[7]，尤其是一些含有氨基还原酮结构的美拉德反应产物[8-11]。以鱿鱼内脏的酶解液为基料，通过Maillard反应制备天然健康的海鲜调味料对于拓宽鱿鱼内脏的应用范围，提升其价值具有重要意义。本文以鱿鱼内脏酶解液为基料，通过美拉德反应制备风味产物，并探索葡萄糖、pH、温度及时间等因素对美拉德产物风味的影响，研究美拉德反应前后氨基酸组分的变化情况，旨在为制备营养丰富、风味浓郁的海鲜风味调味料提供技术和理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鱿鱼（阿根廷鱿鱼） 市售；中性蛋白酶500LAPU/g，诺维信公司；葡萄糖、柠檬酸 均为食品级。

PB-10型pH计 赛多利斯公司；赛康BL301B3绞肉机 上海赛康电器有限公司；DK-8D型电热恒温水槽 上海一恒科技有限公司；日立L-8900型氨基酸全自动分析仪日立高新技术公司。

1.2 实验方法

1.2.1 酶解液制备 将鱿鱼内脏（含水量70%）和水按1∶1混合，置于酶反应器中，搅拌器不停搅拌，在自然pH、45℃下加1%中性蛋白酶反应4h，4500r/min离心20m in后取上清液[12]。

1.2.2 美拉德产物的制备 在锥形瓶中加入10m L的上述酶解液，加入占酶解液一定质量的葡萄糖搅拌均匀，用0.1mol/L NaOH溶液和10%的柠檬酸溶液调至一定pH，封口置于一定温度的水浴锅中反应一定时间后取出，流水冷却。

1.2.2.1 pH对鱿鱼内脏水解液美拉德产物风味的影响 将酶解液的pH分别调至5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，葡萄糖加入量为1.5%，在100℃反应60m in。进行感官评定。

1.2.2.2 时间对鱿鱼内脏水解液美拉德产物风味的影响 将酶解液pH调至8.0，在100℃，葡萄糖加入量为1.5%，分别反应30、40、50、60、70m in。进行感官评定。

1.2.2.3 温度对鱿鱼内脏水解液美拉德产物风味的影响 将酶解液pH调至8.0，葡萄糖加入量为1.5%，在80、85、90、95、100℃反应50m in。

1.2.2.4 葡萄糖添加量对鱿鱼内脏水解液美拉德产物风味的影响 将酶解液pH调至8.0，葡萄糖添加量分别0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%，在100℃反应50m in。

1.2.2.5 正交实验 根据上述单因素实验得出的结果，对反应pH、反应温度、反应时间和葡萄糖添加量进行四因素三水平的正交优化。

表1 四因素三水平正交优化表Table1 Orthogonal optimization of four factors and three levels

1.2.3 感官评定 美拉德反应产物的感官评定方法：评分检验法[13]。采用9点快感标度测定法对样品进行总体风味接受性测定，以腥味、肉香味、海鲜味、香甜味、烤香味、焦糊味、苦味、咸味以及色泽为评价指标，由10人组成的评价小组对每个样品的总体接受性按照9点快感标度测定法评分，对每个样品按0～9打分，9=极喜欢，8=非常喜欢，7=喜欢，6=较喜欢，5=一般，4=较不喜欢，3=不喜欢，2=非常不喜欢，1=极不喜欢，结果取平均值。

1.2.4 氨基酸组分分析 利用氨基酸自动分析仪分析美拉德反应前、后氨基酸组分变化情况。

2 结果与讨论

2.1 优化美拉德反应条件

2.1.1 pH对美拉德产物感官风味的影响 体系pH对美拉德反应产物种类的影响至关重要，其影响是通过羰基和氨基在不同pH环境中可进行不同程度的离子化来实现的[14]。当pH大于7时，Amadori重排的结果产生了还原酮，如4-羟基-5-甲基-2，3-二氢呋喃-3酮（HMFone）和一些诸如丙酮醇、丙酮醛和双乙酰的产物，这些物质进一步参与美拉德反应[15]。如图1所示，当pH5～8时，随着pH的增加，感官评分随之增加，原腥味逐渐减弱，鲜味逐渐增强，样品颜色由淡黄色不断加深。当pH9时，感官评分降低，可能由于美拉德反应剧烈，产生焦糊味。这说明pH过低和过高都不利于美拉德反应风味物质的形成，但偏碱性的环境有利于美拉德反应的进行。由感官评分可知，pH为8时美拉德产物感官风味较好。

图1 不同pH值对水解液美拉德反应产物感官评分的影响Fig.1 Effects of pH on the sensory evaluation of Maillard reaction products

2.1.2 反应时间对美拉德产物感官风味的影响 如图2所示，当反应时间为30min时，感官评分较低，原腥味较重，可能是由于反应不彻底，随着反应时间的延长，氨基酸和还原糖不断反应，产物风味逐渐增强，当反应时间为50m in时，感官评分最高，产物风味最浓郁。但是当反应时间超过50min时，产物明显地产生其他杂味和焦糊味。这说明反应时间对美拉德反应同样很重要，反应时间太短，反应不完全，而反应时间太长，会产生一些不良气味。由感官评分可知，反应时间为50m in时美拉德产物感官风味较好。

图2 不同反应时间对水解液美拉德反应产物感官评分的影响Fig.2 Effects of time on the sensory evaluation of Maillard reaction products

2.1.3 反应温度对美拉德产物感官风味的影响 美拉德反应是一个反应网络，温度的高低会使反应网络沿着不同的反应支路而生成不同的风味，因此温度对美拉德反应中风味物质的形成具有重要影响[16]。有研究表明，80～120℃范围内，褐变速率会随着温度的上升而加快，超过120℃后，褐变速率又会趋于平缓[17]。本次实验选取的温度范围是80～100℃。如图3所示，温度在80～100℃范围内，随着温度的升高，产物的感官综合评分也不断的增加，产物原腥味逐渐减少，颜色由淡黄色逐渐加深。可能是由于温度的升高会增加糖和氨基酸组分的反应活性，产生大量的挥发物质。由感官评分可知，反应温度为100℃时美拉德产物感官风味较好。

图3 不同反应温度对水解液美拉德反应产物感官评分的影响Fig.3 Effects of reaction temperature on the sensory evaluation ofMaillard reaction products

2.1.4 葡萄糖添加量对美拉德产物感官风味的影响

葡萄糖是美拉德反应的必要条件之一，葡萄糖的添加量必然会对美拉德反应产生影响。如图4所示，当葡萄糖添加量为0.5%时，产物感官评分较低，原腥味较重，随着葡萄糖添加量的增加，感官评分随之增高，当葡萄糖添加量为1.5%时，感官评分值达到最高，反应产物香味浓郁，且容易辨别，美拉德反应适中；当葡萄糖添加量继续增加时，可能发生焦糖化反应，感官评分逐渐下降，产物风味也较差，杂味重。由感官评分可知，葡萄糖添加量为1.5%时美拉德产物感官风味较好。

图4 不同葡萄糖添加量对水解液美拉德反应产物感官评分的影响Fig.4 Effects of glucose dose on the sensory evaluation of Maillard reaction products

2.1.5 正交实验优化美拉德反应条件 从表2数据进行极差分析，影响反应产物风味评分的重要程度依次是：pH=温度＞时间=葡萄糖添加量，即pH及温度对产物风味的影响最大，葡萄糖添加量对产物风味的影响最小；最佳反应条件为：pH 7.5、时间45m in、温度95℃、葡萄糖添加量1.5%；由方差分析表3可知pH、温度、时间和葡萄糖添加量对实验结果有差异但并不显著。

表2 四因素三水平正交优化结果Table2 Results of the orthogonal optimization of four factors and three levels

表3 方差分析表Table3 Analysis of variance

2.2 美拉德反应前后氨基酸组分分析

表4 美拉德反应产物中主要氨基酸的组成变化Table4 Changes of themain amino acids component in the Maillard reaction products

美拉德反应前水解液和反应后产物的氨基酸组成如表4所示。氨基酸减少比例较明显的主要有：组氨酸（86.71%）、脯氨酸（39.11%）、精氨酸（16.18%）、苯丙氨酸（15.96%），说明这几种氨基酸是参与该美拉德反应产香味的主要氨基酸。另外，鱿鱼内脏水解液中含有较多的鲜味物质谷氨酸，且美拉德反应后仅减少5.88%，这对利用水解液进行美拉德反应制备鲜味调料有重要的意义。

3 结论

本实验比较了不同pH、不同时间、不同温度和不同葡萄糖添加量对鱿鱼内脏酶解液美拉德反应产物风味的影响，并利用正交实验获得最佳的美拉德反应条件为：葡萄糖添加量1.5%、反应温度95℃、pH7.5、反应时间45min。

通过比较水解液美拉德反应前、后氨基酸的组成及变化情况，发现美拉德反应后氨基酸含量普遍降低；变化较明显的氨基酸是组氨酸、脯氨酸、精氨酸以及苯丙氨酸，说明这几种氨基酸可能是参与该美拉德反应产香味的主要氨基酸；鲜味氨基酸天冬氨酸和谷氨酸的损失较小，必需氨基酸总含量较高，具有良好的营养性。

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