产蛋白酶海洋细菌的筛选、鉴定及发酵培养基的研究

郇惠杰，钟泓波，雷芬芬，崔 春，赵谋明

（华南理工大学轻工与食品学院，广东广州510640）

蛋白酶是一类非常重要的水解酶，是三大工业用酶之一，销售额约占全球酶制剂市场的60%。其中，来源于细菌的蛋白酶比来源于动物和真菌的更具有前景，占据了世界市场的20%，主要用于蛋白质深加工、皮革、医药、洗涤剂、饲料等行业中[1-2]。

海洋是生命的发源地，它占据了地球表面积的70%，包含了地球生物资源的80%。由于海洋环境的特殊性（高盐、高压、低温、营养稀缺等），海洋微生物与陆生微生物在代谢系统与防御体上有着明显的差异，是获取新型酶，如极端酶，特别是耐盐、耐碱、耐热、耐冷蛋白酶的重要资源库[3-4]。1972年Nabou Kato等[5]首次报道了海洋来源的蛋白酶，之后一些可用于新型工业的海洋微生物酶被相继报道。然而，由于受到产酶海洋微生物样品采集和开发技术的限制，该领域的发展缓慢。近年来，借助于海洋生物高新技术，海洋生物酶研究得到了快速的发展。国内外从海洋细菌、真菌、霉菌等微生物中分离得到多种具有开发潜力的酶制剂。目前，已报道的海洋微生物酶有：蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶、果胶酶、DNA聚合酶、溶菌酶等。本文从深海海泥中筛选出产蛋白酶活力高且具有耐盐性的细菌，对其进行微生物学鉴定，研究其所产蛋白酶酶学性质，优化发酵培养基，以期为工业生产、应用提供新的菌株与酶制剂。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

样品 不同经纬度、不同取样方式的中国南海深海海泥中筛选，具体信息如表1所示；酪氨酸Sigma公司；酵母粉 广东环凯微生物科技有限公司；蛋白胨 北京奥博星生物技术有限公司；Alcalase、木瓜蛋白酶、水解蛋白酶FG、胰酶、复合蛋白酶 诺维信；蔗糖酯类S-1670、S-170、SE-15、1170

丹尼斯克；吐温-80 天津市科密欧化学试剂有限公司；丙三醇 国药集团化学试剂有限公司；Folin试剂 根据参考文献自配[6]；其他试剂 国产分析纯；富集、活化培养基 Zobell 2216 E培养基；酪蛋白固体培养基 酪蛋白10.0g、牛肉膏3.0g、NaCl 5.0g、K2HPO42.0g、琼脂15.0g、蒸馏水1L，pH 7.4；基础发酵培养基 葡萄糖5.0g、酵母粉10.0g、KH2PO40.5g、MgSO4·7H2O 0.3g、（NH4）2SO41.0g、CaCl21.0g、NaCl 1.0g、蒸馏水1L，pH 7.2。

PHS-25数显pH计 上海精密科学仪器有限公司；GL-21M高速冷冻离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司；HZQ-X300C恒温振荡培养箱 上海一恒科学仪器有限公司；UV-2100紫外可见分光光度计尤尼柯仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 产蛋白酶菌株初筛 称2g海泥于50m L锥形瓶中，加入10m L无菌水于37℃，150r/m in的培养箱中振荡20m in，静置一段时间，取1m L上清液于富集培养基中，37℃培养12h。用生理盐水按10倍稀释法将富集培养后的菌悬液稀释至10-8。分别取0.1m L 10-6～10-8稀释液，涂布于酪蛋白平板培养基上，于25℃下培养48h后，挑选产生明显水解圈的菌株进行划线分离纯化。

1.2.2 菌株复筛 挑取在斜面上分离纯化后的菌株，将其转接于种子培养基中，25℃，150r/min条件下培养12h。以1%的接种量转接于发酵培养基中（25m L/250m L锥形瓶），25℃，150r/m in培养48h。将发酵液在10000r/min，4℃条件下离心10min，过滤制得粗酶液。测定粗酶液的蛋白酶活力，选取蛋白酶活力最高的菌株进行下一步研究。

1.2.3 蛋白酶活定义及计算 1m L酶液在40℃，pH 7.2的条件下，每分钟水解酪蛋白产生相当于1μg酪氨酸所需要的酶量，定义为一个酶活单位（U）[7-8]。

A=105.24ΔOD660-1.8888

酶活力（U/m L）=A（4/10）n

式中：ΔOD660：660nm处样品测定与空白实验光密度值之差；A：福林试剂标准曲线中，不同ΔOD660对应的值；4：反应体系总体积，m L；10：反应时间，min；n：酶液稀释的倍数。

1.2.4 蛋白酶活测定 采用福林-酚法显色法测定蛋白酶活[9]。具体步骤为：将pH 7.2的2%酪蛋白溶液放入40℃恒温水浴中预热5m in；将粗酶液按一定倍数稀释；在样品管与空白管中各加入1.0m L稀释液；样品管中加入1.0m L酪蛋白，混匀；40℃保温；10min后在样品管中加入2.0m L三氯乙酸（TCA）终止酶促反应，保温20m in；离心，取1.0m L上清液，加入5.0m L 0.4mol/L Na2CO3溶液，Folin试剂1.0m L，40℃显色20min；紫外分光光度计测定在660nm下的吸光值。空白管中先加入TCA，再加酪蛋白，其他步骤同上。空白、样品管一式三份。

1.2.5 16S rDNA片段的PCR扩增 用16S rDNA通用引物Eubac27F：5’-AGAGTTTATCCTGGCTCAG-3’；和Eubac1492：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’对其进行PCR扩增。PCR扩增条件：95℃预变性5m in，然后95℃30s，55℃30s，72℃1.5m in，循环24次；72℃延伸10m in。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，进行检测。

1.2.6 菌体生物量测定 紫外可见分光光度计于600nm处测定发酵液的吸光值（OD），作为菌体生物量的衡量指标。

2 结果与分析

2.1 海洋细菌筛选结果

复筛过程中，蛋白酶活力最高的为90U/m L，筛选此菌株的海泥样品号为11E109B。

2.2 菌株鉴定

2.2.1 形态特征 将C-7菌种划线接种于酪蛋白平板培养基上培养48h，肉眼观察菌落的形态与特征，并在光学显微镜下观察记录细菌的形态学特征，结果如表2所示。

表1 中国南海深海海泥采集信息Table1 The information of seamud from the South China Sea

表2 菌株形态特征Table2 Morphological characteristics

2.2.2 生理生化实验结果 C-7各项生理生化指标如表3所示。

表3 生理生化特征Table3 Physiological and biochemical characteristics

结果表明，海洋细菌C-7具有较好的氯化钠耐受性，可以水解明胶，能够利用淀粉、果糖、葡萄糖、甘露醇等碳源，在硫酸铵与硝酸铵中均能够生长。

2.2.3 菌株的系统发育分析 将16S rDNA全序列结果在NCBI网站上利用BLAST软件进行分析比对，结果显示该菌株与苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis strain的同源性达到99%。采用ClustalW和MEGA5.1软件构建系统发育树，如图1所示。

图1 C-7的系统发育进化树Fig.1 Phylogenetic tree of C-7

由图1可知，该菌株与Bacillus thuringiensis同属一个分支。结合菌株菌落形态、生理生化鉴定结果，鉴定菌株C-7为苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）。

2.3 菌株C-7所产蛋白酶学性质

2.3.1 温度对所产蛋白酶活影响 将稀释了一定倍数的粗酶液置于20、30、40、50、60℃下，分别测定所产蛋白酶活，结果如图2所示。

图2 温度对所产蛋白酶活影响Fig.2 Effectof temperature on enzyme activity

结果表明，该酶在40～50℃范围内有较高蛋白酶活，最适作用温度为50℃，属于中温蛋白酶。

2.3.2 pH对所产蛋白酶活影响 配制pH为5、6、7、8、9、10、11、12的2%的酪蛋白溶液，分别测粗酶液在不同pH条件下的蛋白酶活。测定结果如图3所示。

图3 pH对所产蛋白酶活影响Fig.3 Effect of pH on enzyme activity

结果表明，C-7所产蛋白酶活随pH的增大先增高后降低，pH在7～8处均具有较高蛋白酶活，在pH 7处达最大值，由此推断该菌株所产蛋白酶属于中性蛋白酶。

2.3.3 NaCl浓度对所产蛋白酶活的影响 NAN-WEI SU等[10]研究了NaCl浓度对蛋白酶活的影响，结果表明，NaCl浓度对蛋白酶活具有显著影响，一株米曲霉所产蛋白酶在18%NaCl条件下，酶活仅残存3%，严重影响了其酶解效果。实验分别在NaCl浓度为0%、15%、18%的条件下，比较自制蛋白酶与商业蛋白酶的耐盐性（将0%NaCl条件下的相对蛋白酶活定为1）。结果如图4所示。

图4 NaCl浓度对不同蛋白酶影响Fig.4 Effectof NaCl concentration on enzyme activity

结果表明，所选5种商业酶与自制蛋白酶在NaCl浓度递增的条件下均有不同程度的失活，与K lomk lao等[11]的研究结果相符。当盐浓度为15%时，自制蛋白酶酶活（残留43%）与胰酶酶活（残留42%）耐盐性相当，比复合蛋白酶酶活（残留26%）耐盐性好；当盐浓度为18%时，自制蛋白酶（残留32%）比复合蛋白酶耐盐性（残留17%）好。

2.4 发酵培养基的确定

2.4.1 碳源的确定 碳源对蛋白酶生产的影响比较复杂，除了供给微生物生长所需要的碳源和能量外，通常情况下对细菌产酶还具有诱导和阻遏作用。为了提高酶活，应选择对蛋白酶有诱导作用，而无阻遏作用或者阻遏作用小的物质作为碳源[12]。在基础发酵培养基中分别添加与葡萄糖等量的可溶性淀粉、蔗糖、乳糖、麦芽糖、玉米淀粉、马铃薯淀粉、玉米粉、麸皮，其他条件完全相同，测定粗酶液酶活及生物量。结果如图5所示。

图5 不同碳源的产酶情况Fig.5 Different carbon sources effecton enzyme activity

结果表明，以葡萄糖为碳源时，所产蛋白酶活最高，其对蛋白酶的诱导作用最为明显，确定该菌发酵培养基的最佳碳源为葡萄糖。实验过程中发现，当以相同的发酵培养基对所筛菌株进行培养时，生物量与所产蛋白酶活之间具有一定的相关性，生物量高时所产蛋白酶活不一定高，但生物量低时所产蛋白酶活一定低。

2.4.2 氮源的确定 影响蛋白酶产量的另外一个重要因素为氮源。在添加最佳碳源的基础上，在基础发酵培养基中分别添加与酵母粉等量的蛋白胨、胰蛋白胨、大豆粕、牛肉膏、尿素、硝酸铵，其他条件完全相同，测粗酶液酶活及生物量。结果如图6所示。

图6 不同氮源的产酶情况Fig.6 Differentnitrogen sources effecton enzyme activity

结果表明，该菌株在添加无机氮的培养基中生长受到限制，产酶能力也显著下降，与陈鸿图[12]的研究结果一致。而在蛋白胨、胰蛋白胨、大豆粕、牛肉膏中生长良好，对其所产蛋白酶活均有不同程度的提高。其中，蛋白胨对所产蛋白酶提高效果最为显著，其次是大豆粕，但由于大豆粕不溶于水，考虑到实验操作的方便性，最终确定蛋白胨为最佳氮源。

2.4.3 NaCl浓度的确定 在添加最佳碳、氮源的基础上，在基础发酵培养基中添加不同体积分数的NaCl，分别为0、0.1%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、4.5%、5.0%，测粗酶液酶活及生物量。结果如图7所示。

图7 不同浓度NaCl的产酶情况Fig.7 Different NaCl concentration effecton enzyme activity

结果表明，在一定NaCl浓度范围内，蛋白酶活随着NaCl浓度的增加而升高，当NaCl浓度为1%时，促进产蛋白酶效果最显著。超过一定的浓度范围，随着NaCl浓度的增大，菌体生物量减少，所产蛋白酶活也逐渐降低。

2.4.4 无机盐及浓度的优化 在已优化的基础上，分别减少基础发酵培养基中4种无机盐的一种，测其粗酶液蛋白酶活及生物量，确定对所产蛋白酶活有促进作用的无机盐。结果见图8。

图8 不同无机盐种类的产酶情况Fig.8 Different inorganic salteffecton enzyme activity

结果表明，CaCl2、MgSO4·7H2O、KH2PO4对所产蛋白酶均有一定的促进作用，这是主要是因为Ca2+、K+、Mg2+可起到稳定酶、提高酶的耐热性的作用，与包巨南等[13]的研究一致，李川川等[14]研究的海洋弧菌Vibrio sp.pro1中，Mg2+对其产酶具有明显的促进作用。本研究中Ca2+对所产蛋白酶的影响最为显著，而（NH4）2SO4对所产蛋白酶有一定的抑制作用，故将其舍去，下一部实验选取Ca2+进行浓度实验。

对Ca2+按0、0.05%、0.1%、0.15%、0.2%的添加量添加到发酵培养中，测定粗酶液酶活及生物量，结果见图9。

图9 不同CaCl2浓度的产酶情况Fig.9 Different CaCl2 concentration effect on enzyme activity

结果表明，随着Ca2+浓度的增加，产酶受到抑制，当CaCl2浓度为0.05%时所产蛋白酶活最高。

2.4.5 表面活性剂的确定 在已优化的基础上，在培养基中分别添加0.15%的蔗糖酯类S-1670、S-170、SE-15、1170、吐温-80、甘油。结果如图10所示。

图10 不同表面活性剂的产酶情况Fig.1 0 Different surfactanteffecton enzyme activity

结果表明，S-1670、SE-15、1170及吐温-80对所产蛋白酶均有一定的促进作用，这主要是因为表面活性剂可增加细胞的通透性，进而提高分泌蛋白的表达量[15]。其中S-1670和吐温-80的促进作用最为显著，但由于S-1670溶解性较差，而吐温-80在水中溶解性较好，综合考虑选择吐温-80。

综上，发酵培养基确定为：葡萄糖5.0g，蛋白胨10.0g，KH2PO40.5g，MgSO4·7H2O 0.3g，NaCl 10.0g，CaCl20.5g，吐温-80 1.5g，蒸馏水1L，pH 7.2。此时，所产蛋白酶酶活由初筛的90U/m L提高到了318U/m L。

3 结论

本研究从南海深海海泥中筛选出一株产蛋白酶活最高的细菌C-7，结合生理生化实验及16S rDNA基因序列鉴定为苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）。该菌株所产蛋白酶的最适反应温度为50℃，最适pH 7，属于中温中性蛋白酶，该蛋白酶在15%NaCl条件下仍能保持原有酶活的43%，具有良好的耐盐性。最终确定产蛋白酶培养基为：葡萄糖5.0g，蛋白胨10.0g，KH2PO40.5g，MgSO4·7H2O 0.3g，NaCl 10.0g，CaCl20.5g，吐温-80 1.5g，蒸馏水1L，pH 7.2。

大豆粕为价格低廉的植物蛋白质，本研究中的菌株在以大豆粕为氮源的条件下，生长良好，与最佳氮源蛋白胨所产蛋白酶活相当，若将其用于工业发酵，可以大大降低成本，具有很好的开发前景。

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