基于常压室温等离子体技术诱变选育D-乳酸高发酵速率菌株

柏中中，孙家夺，吴 斌

（南京工业大学生物与制药工程学院，江苏南京211816）

D-乳酸是重要的手性中间体与有机合成原料，广泛应用于化工、高效低毒农药及除草剂、化妆品等领域的手性合成。近年来，高光学纯度的D-乳酸因其在提高聚乳酸材料性能方面的实际应用而得到了更多的关注[1]。目前D-乳酸的工业生产主要采用微生物发酵法。产光学纯D-乳酸的微生物主要分布在乳杆菌属（Lactobacillus）、芽孢杆菌属（Bacillus）、芽孢乳杆菌属（Sporolactobacillus）和明串珠菌属（Leuconostoc）[2]。与L-乳酸发酵生产相比，D-乳酸在发酵菌种的多样性及发酵水平方面仍具有较大的差距[3]，因此进一步改良D-乳酸的生产菌株对于扩大乳酸产品的种类和应用领域具有重要的意义。

诱变育种是工业上提高菌种性能的常用手段。近年来，研究者已利用化学诱变剂、紫外照射及低能离子注入等方法进行D-乳酸高产菌株的选育[4-6]。常压室温等离子体（ARTP）具有射流温度低、产生的等离子体均匀、与生物大分子和细胞作用明显等优点，是快速突变微生物基因组的有效方法。目前已应用于链霉菌、茂源链轮丝菌及木葡糖酸醋杆菌等微生物的诱变选育[7-9]，但尚未有利用ARTP诱变选育D-乳酸生产菌的报道。

在前期研究过程中，本课题组采用离子束诱变选育获得一株D-乳酸稳定高产菌Sporolactobacillus sp.Y2-8。该菌株摇瓶产酸量达120～140g/L，但发酵过程中菌体的比生长速率和乳酸产率均相对较低（摇瓶发酵时间150～160h）[6]，过长的发酵时间增加了生产成本及发酵过程中的染菌几率。本研究以Y 2-8为出发菌株，利用ARTP选育高产量、高发酵速率的突变株，为D-乳酸的发酵生产奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

芽孢乳杆菌Sporolactobacillus sp.Y2-8（CCTCC No：M 208052） 由本实验室选育获得；酵母粉、蛋白胨、葡萄糖、琼脂粉等试剂 均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司；玉米浆 取自安徽丰原发酵技术工程研究有限公司。

常压室温等离子生物育种机 北京思清源生物技术有限公司；U-3000型高效液相色谱仪 美国热电公司；SBA-40型生物传感仪 山东省科学院生物研究所；雷磁PHS-3E型pH计 上海精密科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 培养基组成及培养方法 固体培养基（g/L）：葡萄糖20，酵母膏2，蛋白胨2，玉米浆2m L/L，KH2PO41，CH3COONa 2，MgSO40.2，琼脂20，pH 7.0。

种子培养基（g/L）：葡萄糖20，酵母膏2，蛋白胨2，玉米浆2m L/L，MgSO40.2，麸皮2，CaCO314，pH 7.0。

发酵培养基（g/L）：葡萄糖150，酵母膏5，玉米浆15m L/L，MgSO40.5，麸皮15，CaCO390，pH 7.0。

高糖-溴甲酚绿筛选平板（g/L）：葡萄糖150，溴甲酚绿0.1，其他组成酵母膏、蛋白胨、玉米浆等组分及其含量与固体培养基组成相同。将生长于固体平板上的菌种接入种子培养基，石蜡液封，摇床转速180r/m in，37℃条件下培养14h，然后以10%的接种量接入发酵培养基，石蜡液封，37℃下培养至培养基固化，记录发酵时间。

1.2.2 ARTP诱变方法 本研究利用高纯氦气作为工作气体，通气量为10L/m in，功率为100W，照射距离2mm，处理菌液10μL。诱变过程的可变操作参数是处理时间，为了寻找最佳的诱变条件，首先需要获得菌株的致死率曲线，因此处理时间从5s，依次增加到180s，然后将处理的样品稀释涂平板，利用平板计数法计算致死率[8]，选择合适的诱变时间。

总之，基层行政事业单位财务管理工作是一项日常性工作，也是一项十分重要的工作。做好这项工作，基层行政事业单位必须锁定财务管理重要性意识锁，锁住人才建设这把锁，挂好财务管理目标锁，用好财务内控管理这把锁，定好财务管理职责这把锁，才能用这些锁把好财务活动这扇大门，防范财务风险于未然。

1.2.3 高通量筛选方法 本研究利用高糖-溴甲酚绿平板作为筛选平板。将诱变后的菌株稀释涂布于高糖-溴甲酚绿平板，37℃厌氧培养，观察菌落周围培养基的颜色变化快慢，选取菌落周围变色最早最明显的单菌落进行摇瓶发酵复筛[6]。

1.2.4 突变株发酵性能筛选 选取目标菌株进行摇瓶发酵实验，比较突变株与原始菌在生物量、葡萄糖消耗量及产D-乳酸性能等方面的差异。

1.2.5 其他分析方法

1.2.5.1 生物量测定 收集发酵液静置5m in，小心吸取0.5m L上层清液于试管中，适当稀释后检测660nm处吸光值，乘以稀释倍数得到菌株生物量OD660。

1.2.5.2 D-乳酸定量分析 采用高效液相色谱进行分析，以柠檬酸为内标物（该菌发酵液中不含柠檬酸，添加量10g/L）。色谱柱，Chromasil C18（Allteck）。流动相，2.5mmol/L NH4H2PO4溶液，流速为0.5m L/m in，柱温为30℃，检测波长230nm。

D-乳酸产量的标准曲线：Y=1.668X-0.0043，R2= 0.99992，式中，X：产物D-乳酸与内标柠檬酸的峰面积比值；Y：对应的产物D-乳酸的浓度（g/L）。

D-乳酸产率按下式计算：Y=C/T。式中，Y：D-乳酸产率；C：D-乳酸浓度；T：发酵时间。

1.2.5.4 D-乳酸的光学纯度分析 采用高效液相色谱法进行测定，层析柱为Sum ichiral CA 5000，柱温35℃。流动相，1mmol/L CuSO4溶液，流速为1m L/m in，检测波长254nm，分析结果与D-乳酸、L-乳酸标准品色谱图进行比较。

1.2.5.5 葡萄糖含量测定 采用SBA-40型生物传感器测定发酵液中残留葡萄糖的浓度。

1.2.6 遗传稳定性分析 将复筛所得的高性能菌株在固体平板上进行6代传代培养，摇瓶发酵分析其产D-乳酸的性能。

2 结果与讨论

2.1 ARTP诱变Sporolactobacillus sp.Y2-8的致死率曲线测定

利用ARTP对菌株Y2-8进行等离子体注入诱变，考察不同注射时间对菌株致死率的影响。由图1可知，等离子体处理时间与菌株Y2-8的致死率之间存在着明显的效应关系，随着照射时间的延长，菌株死亡率迅速增加。在处理60s时，菌株的死亡率为89.2%，处理90s时，菌致死率为95.6%，处理120s以后致死率接近100%。突变具有随机性，目前菌株致死率与正突变之间的关系仍不十分明确，但大量实验表明[7-8，10]，致死率在95%左右，可获得较好的正向突变率。因此本研究选用90s作为菌株诱变的处理时间。

图1 不同照射时间下的致死率曲线Fig.1 Variation of the lethal rate of Sporolactobacillus sp.Y2-8 with the ARTP treatment time

2.2 高产酸速率突变株的快速筛选

高通量筛选是获取目标菌株的重要步骤之一。本实验室在前期的研究过程中，建立了高糖-溴甲酚绿筛选平板[6]，通过比较溴甲酚绿平板上变色圈产生的时间、大小和亮度，筛选获得11株变色圈产生时间较早且较亮的突变株。而后比较该11株突变株与原始菌在筛选平板上产生变色圈的大小与时间差异，最终获得了3株目标菌株。分别命名为Y90s-1、Y90s-2和Y90s-3。

2.3 突变株的发酵性能考察

为进一步了解筛选获得的3株突变株的培养特性，本研究通过考察3株突变株在摇瓶发酵过程中的OD值、发酵液pH、D-乳酸产量及残糖量变化，比较突变株与原始菌的发酵性能差异，结果如图2～图5所示。由图2可知，突变株Y90s-1的生长明显较突变株Y90s-2、Y90s-3及原始菌旺盛，发酵108h后，菌株Y90s-1的OD值达到13.7，而原始菌的OD值为9.7。同时该突变株在发酵初期pH下降也较快，说明与其他三株菌相比，突变株Y90s-1产生了更多的乳酸，而后随着发酵的进行，游离乳酸与中和剂CaCO3反应生成中性乳酸钙，使发酵液的pH基本维持在4.5～5之间（图3）。从图4可见，突变株Y90s-1发酵过程中的耗糖速率也明显快于原始菌和突变株Y90s-2、Y90s-3。进一步比较突变株与原始菌发酵产D-乳酸的效率，结果见图5。在菌株发酵过程中，随着发酵时间的延长，D-乳酸浓度不断增加，乳酸钙的含量也不断增加。当乳酸钙的含量超过此发酵温度下乳酸钙的饱和浓度时，D-乳酸开始析出，最终整个发酵液固化。突变株Y90s-1在发酵116h后，整个发酵液固化，D-乳酸的浓度为122.4g/L，产率为1.05g/（L·h）。原始菌Y2-8的发酵固化时间为156h，D-乳酸的浓度为118.4g/L，产率为0.77g/（L·h）。突变株Y90s-1的发酵时间比原始菌缩短了40h，其D-乳酸生产强度比原始菌提高了36.3%。

图2 原始菌和突变株的生长曲线Fig.2 The growth curves ofwild strain and mutants

图3 原始菌与突变株发酵液pH变化Fig.3 pH of the broth ofwild strain and mutants

图4 原始菌与突变株的残糖量Fig.4 Fermentation residual sugar ofwild strain andmutants

图5 原始菌与突变株的D-乳酸产量Fig.5 Fermentation yield of D-lactic acid ofwild strain and mutants

2.4 产物的光学纯度分析

利用手性柱分析突变株Y90s-1发酵产物的光学纯度（图6），结果表明菌株Y90s-1发酵所产的D-乳酸光学纯度达到了99.9%。

图6 乳酸标准品及发酵液样品的HPLC图Fig.6 HPLC chromatogram analysis of the standard of lactic acid and fermentation sample

2.5 遗传稳定性分析

为检测突变株Y90s-1的遗传稳定性，传代过程中对各代的突变株进行D-乳酸产量及发酵时间检测。从1～6代，D-乳酸的产量及发酵时间均保持稳定（图7），结果表明，ARTP诱变选育的菌株Y90s-1保持着良好的遗传稳定性。

图7 Y90s-1的遗传稳定性Fig.7 The analysis of genetic stability formutant Y90s-1

3 结论

本研究采用ARTP诱变选育高发酵速率的D-乳酸产生菌，这种诱变方法在D-乳酸产生菌选育中首次应用，取得了良好的效果。筛选得到一株发酵速率提高了36.3%的突变株Y90s-1，并通过传代实验验证了该突变株具有良好的遗传稳定性。本研究为D-乳酸产生菌的性能改良提供了一条新途径。

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