野菊花茎叶挥发油的化学成分及其对植物病原真菌抑制作用

2013-02-21刘晓丹刘存芳赖普辉赵赟恺

食品工业科技 2013年24期

刘晓丹，刘存芳，赖普辉，赵赟恺，吝敏，陈凯

（陕西理工学院化学与环境科学学院，陕西汉中723000）

野菊花（Chrysanthemum indicum L.）是菊科菊属的一种多年生草本植物[1]，俗称山菊花、野黄菊花、甘菊花等，在我国大部分地区均有分布，资源十分丰富，陕西南部盛产野菊花。中国药典中记载野菊花有清热解毒、平肝明目、降低血压等功效。本草纲目中汇载，野菊花能治疗痈肿、疮毒等。现代药理学研究表明，野菊花具有广谱抗菌活性[2]，有保护心脏，降压，解热，抑制血小板聚集，增强免疫，抗病毒，抗肿瘤[3]，抗炎，清除氧自由基，保肝养肝等作用。近年来人们对野菊花中的化学成分进行了大量研究，野菊花中含有多糖[4]、萜类物质、黄酮类物质[5]、蛋白质和氨基酸、营养元素[6]、挥发油[7]、维生素、色素等多种活性成分，通常人们的研究多集中在野菊花的头状花序中化学成分的分析测试和活性研究[7]，并利用多种提取溶剂对野菊花的头状花序中活性成分进行提取和活性测试研究[8-10]，对野菊花挥发油成分及生物活性的研究报道也较多[7，11]，但对野菊花茎叶中挥发油开发和利用的研究报道较少。这里用普通的水蒸气蒸馏法从秦巴山区野菊花的茎叶中提取挥发油，采用气相色谱-质谱联用技术对野菊花茎叶中的挥发油化学成分进行分离和鉴定，运用峰面积归一化法确定野菊花茎叶中的挥发油各个化学成分的相对百分含量，并对其挥发油进行植物病原真菌的抗菌活性研究，为进一步开发利用秦巴山区野菊花植物资源提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

野菊花全草在2012年10月中旬收集于陕西省汉中市巴山山区，经过陕西理工学院植物学科专家赵桦教授鉴定，认定是菊科菊属的野菊花（Chrysanthemum indicum L.）植物，取其茎叶，阴干粉碎，密封保存备用；油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）、烟草赤星病菌（Alternaria longipes）、核桃果炭疽病菌（Pathogenic bacteria）、苹果炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea），5种供试细菌菌种均购自中国普通微生物菌种保藏中心；马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基；无水硫酸钠 AR，西安化学试剂厂；丙酮、氯化钠 AR，开封化学试剂总厂；无水乙醚 AR，西安三浦化学试剂有限公司；水为二次蒸馏水。

Agilent 7890A-5973N型GC-MS仪美国安捷伦公司；DOB-20003型光电分析天平重庆实验设备厂；LRH-250A型生化培养箱广东省医疗器械厂；FW 100型中草药粉碎机天津市泰斯特仪器有限公司；水蒸气蒸馏装置天津化玻仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 野菊花茎叶挥发油的提取称取野菊花的茎叶粉末100g，用水蒸气蒸馏法提取其挥发油10h[12]，蒸馏出来的溶液用氯化钠饱和后，用乙醚萃取三次，上层萃取液用无水硫酸钠干燥过夜，低温蒸馏回收乙醚，得到一种有特殊清香气味的黄色油状物1.63g，实验重复5次，其挥发油的平均收率为1.63%，低温密封保存备用。

1.2.2 野菊花茎叶挥发油的GC-MS分析利用气相色谱-质谱联机对野菊花茎叶挥发油进行分离和分析测定，通过数据处理系统检索谱图库，确定所得野菊花茎叶挥发油的化学成分及相对含量。

色谱条件：色谱柱型号：HP-5（30m×250μm×0.5μm）弹性石英毛细管柱；载气为99.999%的高纯氦气，柱温：柱温50℃，保持1m in后，再以8℃/m in的升温至280℃，保持3min；进样口温度为280℃，流速为1.0m L/m in，进样量0.2uL，分流比为10∶1。质谱条件：EI离子源，电离能量70电子伏特，离子源温度230℃，扫描范围40～550质量单位，扫描模式：全扫描。

1.2.3 野菊花茎叶挥发油抑制植物病原真菌的作用

采用菌丝生长速率法，测定野菊花茎叶挥发油对5种供试病原菌菌丝生长的抑制作用。将野菊花茎叶挥发油用丙酮溶解，加入无菌水稀释配制成所需浓度，在无菌条件下与PDA培养基混合制成含药平板。设丙酮空白对照，每次处理重复3次。用钻孔器打取直径5mm的菌饼，菌丝面向下接种于含药平板上，放入25～26℃生化培养箱中恒温培养。用十字交叉法分别于处理后36h测定菌落生长直径，根据式（1）和式（2）来计算菌丝生长抑制率。

2 结果与讨论

2.1 野菊花茎叶挥发油的成分分析

每一个色谱峰对应的质谱图经过GC-MS联用仪的计算机谱库检索进行定性，质谱库为NIST库，版本为Library version 2.0，质谱图与其对应图谱的相似度（SI）均在85%以上。野菊花茎叶挥发油中的各个化学成分的相对含量依据总离子流图由计算机采用峰面积归一化法统计[13]。野菊花茎叶挥发油中的各个化学成分确定结果列于表1中。由表1可知，从野菊花茎叶挥发油中分离出48种谱峰，鉴定出的化学成分为32种，占挥发油总量的65.75%，主要是单萜类、倍半萜类化合物及其含氧衍生物，其中相对含量较高的成分有2-（亚-2，4-已二炔基）-1，6-二氧螺[4，4]壬-3-烯（17.93%），樟脑（11.40%），7，11-二甲基-3-亚甲基-1，6，10-十二碳三烯（9.44%），桉树脑（5.64%），冰片（3.87%）等挥发性化合物。在文献报道的野菊花挥发油成分中，最多确定出的化合物有54种[7]，最少的有18种[11]。野菊花的茎叶挥发油中的化学成分比野菊花的花序挥发油中的化学成分更为复杂多样，成分种类差异也较大，虽均含有樟脑、冰片、松油醇、石竹烯氧化物[14]，但含量不同，其中在野菊花挥发油中石竹烯氧化物占25.196%，樟脑占1.75%，而在其茎叶挥发油中石竹烯氧化物只占到0.78%，樟脑占了11.40%。在野菊花的茎叶挥发油中发现了含量较高的2-（亚-2，4-已二炔基）-1，6-二氧螺[4，4]壬-3-烯，含量高达17.93%，这种化学成分在所有对野菊花挥发油中的研究报道中均没有被发现，这说明野菊花的茎叶挥发油有一些特殊的活性成分，其挥发油会具有独特的生物活性，这还有待进一步研究和开发。

2.2 野菊花茎叶挥发油的抑菌活性

野菊花茎叶挥发油的抑菌实验结果如表2所示，不同浓度的野菊花茎叶挥发油对5种供试菌株均表现出不同程度的抑制活性，特别是野菊花茎叶挥发油对油菜菌核病菌的抑制效果明显地要强于对苹果炭疽病菌和核桃果炭疽病菌的抑制效果，野菊花的茎叶挥发油对5种植物病原真菌的抑菌活性大小依次为：油菜菌核病菌＞苹果炭疽病菌＞烟草赤星病菌＞番茄灰霉病菌＞核桃果炭疽病菌。实际上植物挥发油呈现出多种独特的生物活性，如有抗氧化活性可清除羟基自由基、消炎、理气、止痛、灭菌、清热解毒等[12]，一些已用于保健、卫生、医疗和食品工业[13]，开发野菊花茎叶挥发油有广阔的前景。野菊花茎叶挥发油是一种具有抑菌活性的物质，其主要抑菌成分及含量还有待进一步研究。

3 结论

从秦巴山区野菊花的茎叶中提取挥发油，用GC-MS联用技术分离和鉴定出了32种化学成分，其主要是单萜类、倍半萜类化合物及其含氧衍生物，和文献报道的野菊花挥发油中的成分相比较[7，11]，成分种类差异较大，但是一些主要成分是一致的[14]。在野菊花的茎叶挥发油中发现了含量较高的成分：2-（亚-2，4-已二炔基）-1，6-二氧螺[4，4]壬-3-烯（2-（hexa-2，4-diyn-1-ylidene）-1，6-dioxas-piro[4，4] non-3-ene），其含量高达17.93%。野菊花的茎叶挥发油在测试浓度范围内对5种供试菌株均有明显的抑制作用，抑菌活性大小依次为油菜菌核病菌＞苹果炭疽病菌＞烟草赤星病菌＞番茄灰霉病菌＞核桃果炭疽病菌，对油菜菌核病菌的抑菌作用相对最为显著。这里也仅是对野菊花的茎叶挥发油的抗菌活性做了初步的研究，由于野菊花的茎叶挥发油化学成分种类的复杂多样性，其抗植物病原真菌的活性机理和其他生物活性实验还需要进一步研究。