甜菜碱含量的测定方法比较
2013-02-20王洪荣邹益东朱建泉
■杨 雪 王洪荣 邹益东 朱建泉
(1.扬州大学动物科学与技术学院，江苏扬州 225009；2.宜兴天石饲料有限公司，江苏宜兴 214200)
甜菜碱是广泛存在于自然界中的各种动植物体内的一种天然营养物质，甜菜碱因为其独特的化学结构，在生命有机体中发挥着多种功能：可作为甲基供体部分取代蛋氨酸和胆碱，可促进蛋白质的合成，促进脂肪分解代谢，提高酮体瘦肉率，提高维生素的效价，调节渗透压，提高抗球虫药疗效，抗应激，理想的诱食剂。已作为一种饲料添加剂广泛应用于动物养殖业中。
目前测定甜菜碱含量的方法包括：酸碱滴定法、凯氏定氮法、紫外分光光度法、高氯酸非水滴定法、离子色谱法等。各种方法均有其优缺点，但综合考虑，离子色谱法与高氯酸非水滴定法的测定结果较准确。为了比较这两种方法的测定结果如何，设计如下实验：
1 材料与方法
1.1 仪器与设备
瑞士万通792 Basic IC标准型离子色谱仪，上海良平精密分析天平MP200A（上海良平仪器仪表有限公司生产），KQ-50E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司生产），电热鼓风干燥箱（南通金石实验仪器有限公司生产），79-1磁力加热搅拌器（江苏金坛市金城国胜实验仪器厂生产）。
1.2 实验方法
1.2.1 非水滴定法测定甜菜碱含量
1.2.1.1 非水滴定法的实验原理
甜菜碱在水溶液中呈中性，无法在水溶液中用酸碱滴定法直接测定其含量。但以冰醋酸作为溶剂，用HClO4为滴定剂，则能准确滴定。以结晶紫为指示剂，滴定终点时溶液由紫色变为蓝色。滴定剂常用邻苯二甲酸氢钾基准物质标定，同样以结晶紫为指示剂。
1.2.1.2 材料与试剂
试剂：冰乙酸、醋酸酐、结晶紫指示剂、高氯酸、5种甜菜碱样品（宜兴天石饲料有限公司）、甜菜碱标准品（宜兴天石饲料有限公司，含量98%）。
设备：分析天平、250 ml烧杯、50 ml量筒、2 ml移液管、磁力搅拌器、25 ml酸式滴定管、79-1磁力加热搅拌器（江苏金坛市金城国胜实验仪器厂生产）。
1.2.1.3 实验方法
样品处理：分别取适量的5种待测甜菜碱样品,放于烘箱在（105±2）℃条件下烘2 h,粉碎,过100目筛,放于干燥器内备用。
0.1 mol/l高氯酸标准溶液的配制与标定：称取一定量的高氯酸，注入冰乙酸和乙酸酐，以结晶紫为指示液，滴定邻苯二甲酸氢钾，溶液由紫色变为蓝色时，即为滴定终点。同时做空白试验。最终测得高氯酸标准溶液的浓度c为0.097 9 mol/l。
2%结晶紫指示液的配制：准确称取0.2 g结晶紫，用冰乙酸定容至100 ml。
称样：准确称取0.2 g甜菜碱样品(准确至0.000 1 g),置于250 ml烧杯中。
滴定：分别量取50 ml的冰醋酸和2 ml乙酸酐加入到烧杯中，搅拌均匀。将烧杯中加入2～3滴0.2%的结晶紫指示剂,用高氯酸标准液进行滴定,滴定的同时用磁力搅拌器搅拌。当溶液颜色由紫色变为蓝绿色时即为终点,记录消耗的高氯酸溶液的体积V1(ml)。同时做空白试验，记录消耗的高氯酸溶液的体积为V0(ml)。
根据公式W(%)=[c（V1-V0）×117.15×100]/m，计算甜菜碱的含量（其中V0=0.05 ml）。测得5种甜菜碱样品的甜菜碱含量分别为：97.6%、68.5%、50.3%、31.3%、11.9%。
精密度实验：取3号甜菜碱样品，按照上述方法，重复滴定5次，记录滴定数据，5次实验结果的RSD为0.78%。
验证性实验：甜菜碱标准品（含量98%）三份，按照上述方法，重复滴定3次，试验结果为98.8%。
回收率实验：分别取3号甜菜碱样品1.3 g和甜菜碱标准品0.7 g，按照上述步骤进行滴定。平行测定5份，记录消耗的高氯酸体积。测得平均回收率97.8%。
1.2.2 离子色谱法测定甜菜碱含量
1.2.2.1 原理
用水溶解实验中的甜菜碱，溶液经过液-液萃取净化，将提取液稀释至合适的浓度后，使用阳离子交换柱和非抑制性电导检测器分离测定。
1.2.2.2 材料与试剂
试剂：甜菜碱样品（宜兴天石饲料有限公司）、甜菜碱标准品（宜兴天石饲料有限公司，含量98%）、乙腈、去离子水、0.45 μl系膜。
设备：瑞士万通792 Basic IC标准型离子色谱仪，上海良平精密分析天平MP200A（上海良平仪器仪表有限公司生产），KQ-50E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司生产），电热鼓风干燥箱（南通金石实验仪器有限公司生产）、100 ml容量瓶、50 ml容量瓶、5 ml移液管、滤纸、漏斗。
1.2.2.3 实验方法
样品处理：分别取适量的5种待测甜菜碱样品,放于烘箱在（105±2）℃烘2 h,粉碎,过100目筛,放于干燥器内备用。
色谱分析条件：通过对流动相、流速、柱温的优化，确定甜菜碱的色谱分析条件为：乙腈∶水（75∶925）为流动相，流速为1.0 ml/min，柱温35℃，进样量20 μl。
甜菜碱标准溶液的制备：准确称取0.100 0 g于105℃干燥过的甜菜碱标准品（含量为98%）于100 ml容量瓶中定容，放在超声波清洗仪内，作用20 min后，冷却至室温。
甜菜碱标准曲线的绘制：准确吸取50.0、25.0、5.0、2.5、0.5 ml甜菜碱标准溶液于50 ml容量瓶中，用水定容。该标准工作液浓度分别为1、0.5、0.1、0.05、0.01 mg/ml（该溶液现用现配）。5种溶液各进样20 μl，按上述色谱条件进行分析（色谱分析时，过0.45 μl的系微孔滤膜）。将测定结果以峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标绘制标准曲线。得到甜菜碱含量的回归方程，标准曲线如图1。
甜菜碱实验品的含量测定：准确称取1 g于105℃干燥过的甜菜碱样品，定容至100 ml，用超声波清洗仪作用20 min，冷却后，过滤，吸取滤液5 ml于50 ml容量瓶中定容。混匀，静置20 min后，按照上述色谱条件进行分析。根据标准曲线的回归方程计算甜菜碱含量。根据标准曲线，测得5种甜菜碱样品的浓度见表1。
图1 甜菜碱标准曲线
表1 5种甜菜碱样品的甜菜碱含量
精密度实验：吸取3号供试品溶液，连续进样5次，记录色谱图，测得相对保留时间RSD值＜0.3%，相对峰面积RSD值为0.9%～1.7%。
稳定性实验：按甜菜碱试验品的配制方法制得样品溶液，分别于配制后0、1、3、5、10、15、25 h进样，记录色谱图。测得7个时间点甜菜碱峰面积的RSD值为0.7%～1.2%。
验证性实验：取甜菜碱标准品（含量98%）三份，按照上述方法，连续进样3次，试验结果为97.9%。
回收率实验：取已知含量的3号样品和标准品各1.000 0 g，分别定容到100 ml，过滤，再分别取5 ml定容到50 ml，标号①、②。取①号溶液10 ml，②号溶液5 ml，连续进样5次。按照上述色谱条件进行色谱分析，测定平均回收率。测得平均回收率为101.4%。
图2 甜菜碱样品离子色谱阳离子分析
2 结果及分析
2.1 非水滴定法和离子色谱法测定的不同样品的甜菜碱含量
按照测得甜菜碱浓度由高到低的顺序，列于表2。
表2 非水滴定法和离子色谱法测定的不同样品的甜菜碱含量（%）
由表2可知，相比较而言，离子色谱法测得的甜菜碱含量更接近甜菜碱的实际值。由以上结果可知，非水滴定法测定的甜菜碱浓度均比离子色谱法测定的甜菜碱浓度高，原因可能是：①甜菜碱是一种中性物质，具有强烈的吸湿性能，可能是测定过程中甜菜碱由于吸湿导致了滴定终点误差；②由于操作人员的读数存在误差；③滴定终点的确定存在误差；④冰醋酸中水分含量较高。
2.2 高效液相色谱法测定甜菜碱含量的方法分析
本实验过程中，选择不同比例的乙腈与水的比例为流动相进行优化，结果表明：乙腈∶水（75∶925）为流动相，流速：1.0 ml/min，柱温：35 ℃，分离度较好，达到基线分离。
离子色谱法是将改进后的电导检测器安装在离子交换树脂柱的后面，以连续检测色谱分离的离子的方法。1975年H·斯莫尔等将经典的离子交换色谱与高效液相色谱技术相结合，创造了使用连续电导检测器的现代离子色谱法，它与经典的离子交换色谱的区别在于分离柱的高效能，即现代离子色谱使用小粒度和低交换容量的树脂及小柱径的分离柱，以及进样阀进样，泵输送洗脱液,连续检测,具有快速、方便，灵敏度高，选择性好，可同时分析多种离子化合物，分离柱的稳定性好、容量高等优点。
3 讨论
离子色谱法测定甜菜碱含量具有连续、高效、灵敏等优点，但实验所需时间较长，包括称量、定容、超声波、冷却、稀释、测定等步骤，而高氯酸非水滴定法虽测定的实验结果较离子色谱法准确性低，但实验操作简单，只需称量、处理、滴定即可。并且，高氯酸非水滴定法所需的试剂和设备均为常用试剂和设备，而离子色谱法所用的设备价格较昂贵。所以，可根据实验要求和实验条件，若所测结果不需要特别准确，则可选择高氯酸非水滴定法，该方法价格相对合理并且快速，且试剂均为常见试剂。若对所测的实验结果要求很高，则可选择精确度与准确度均较高的离子色谱法进行测定。
