原料乳中菌落总数检测方法的比较研究
2013-02-20张名爱李洁慧于翠芳杜中彩
■张名爱 李洁慧 于翠芳 杜中彩
(青岛农业大学，山东青岛 266109)
随着近年来我国经济的发展和人们生活水平的提高以及乳制品（尤其是牛乳）需求量的增加，对牛乳及其乳制品的质量要求也越来越高。据统计，到2010年，我国人均奶类食品摄入量达到16 kg，比2000年增加一倍以上，由此看出中国的乳制品消费市场潜力巨大[1]。随着微生物学检测技术的发展，产生了许多关于菌落总数测定的新技术、新仪器、新方法和新标准。
菌落总数用于判定食品被细菌污染的程度及卫生质量，是鲜牛奶重要的质量控制指标之一（鲜牛奶中细菌数要求低于2×105个/ml[2]），在一定程度上标志着食品卫生质量的优劣，它反映食品在生产过程中是否符合卫生要求，以便对被检样品做出恰当的卫生学评价[3]。本次试验对常规检验的3种方法进行比较研究，以期获得理想的并能适应不同具体情况的检验方法，为食品质量检验部门和乳品企业中菌落总数的检测提供参考，并为检测标准的修改提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料与仪器设备
1.1.1 试验材料
原料乳：购自农场。
葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、琼脂、KH2PO4、NaOH及其他药品均为国产。
1.1.2 仪器与设备
PYX-DHS-40×50-13-Ⅱ隔水式恒温培养箱：上海跃进医疗器械厂生产；DHP-9082型电热恒温培养箱：龙口市先科仪器公司生产；HPS-250生化培养箱：哈尔滨市东明医疗器械厂生产；HW.SY21-K电热恒温水浴锅：龙口市电炉制造厂生产；YXQG02型电热式灭菌锅：山东新华医疗器械股份有限公司生产；PHS-3C精密pH计：上海雷磁仪器厂生产；TB-214电子分析天平：北京赛多利斯仪器系统有限公司生产；电子调温万用炉：龙口市先科仪器公司生产；DGX-9243B-1电热鼓风干燥箱：上海福玛试验设备有限公司生产；DHP-9082型电热恒温培养箱：广东银港科技股份有限公司生产。
1.2 试验方法
1.2.1 检验程序
检样→10倍系列稀释→3个适宜样品液，各1 ml加入无菌培养皿内→每皿加入15～20 ml培养基，混匀→倒置培养→计数。
1.2.2 三种标准测定方法比较[4-7]
表1 三种标准的主要区别
1.2.3 测定
①原料乳的稀释
取4个不同批次的原料乳，分别编号为S1、S2、S3、S4。取25 ml原料乳样品于225 ml稀释液中，充分混匀，制成10-1的样品液。取10-1样品液1 ml，沿管壁缓慢注于9 ml稀释液中，混合均匀，制成10-2的样品液，并依次制成10-3、10-4、10-5三个稀释度的样品液。从制备最初的稀释液至倾倒培养基时间间隔不宜超过15 min。
②接种培养
分别取10-3、10-4、10-5稀释度的样品液1 ml，倾注接种。每个梯度每种培养基做2个平板，同时做空白对照。待琼脂凝固后，倒置培养。
③计数
选取无蔓延菌落生长的平板用于计数。培养后每24 h计数，连续72 h。
2 结果与分析
2.1 平皿计数结果
根据三种标准菌落总数测定方法对4个批次原料乳细菌总数的测定结果见表2。
表2 平皿计数结果
由表2结果看出，培养基和稀释液等条件相同，培养温度不同时，FDA BAM-2001的检测结果普遍高于GB/T 4789.2—2010；培养相同时间，菌落总数测定结果的总体情况为：IDF 100A：1987＜GB/T 4789.2—2010＜FDA BAM—2001；由此可知，35 ℃更适合原料乳中细菌的生长繁殖，检出率更高。
2.2 三种方法测定结果的比较
菌落计数报告及三种方法之间的比较见表3。
表3 菌落总数
对表3结果进行比较分析，IDF 100A：1987检出率显著高于GB/T 4789.2—2010和FDA BAM—2001方法，IDF 100A：1987检出率为GB/T 4789.2—2010的2.2倍左右，FDA BAM—2001检出率大约为GB/T 4789.2—2010检出率的1.5倍左右。
2.3 差异显著性分析
对三种检测方法测定结果进行显著性分析，结果见表4。
表4 方差分析
根据统计学数据分析，4种样品间F=0.33＜1，即P＞0.05，样品间无显著差异，说明该测定结果适用于不同样品的检测；三种方法间F=2.09＞F0.05，即P＜0.05，三种方法测定结果存在显著差异，即IDF 100A：1987＞FDA BAM—2001＞GB/T 4789.2—2010。
2.4 测定结果分析
对表2、表3、表4测定结果进行比较分析，IDF 100A：1987检出率最高，营养全面，菌落易于分辨，缺点是检验周期长；FDA BAM—2001优于GB/T 4789.2—2010，其共同优点是方法简单，检验周期短。检验方法中影响检验结果的主要因素包括培养基成分、培养温度、培养时间、计数方法等。
2.4.1 培养基成分
培养基的营养构成为细菌的生长繁殖提供了必需的碳源、氮源、能源、生长因子、无机盐和水等营养元素。GB/T 4789.2—2010和FDA BAM—2001使用的培养基均为平板计数琼脂（PCA）培养基，与世界乳品联合会国际标准IDF 100A：1987使用的IDF培养基相比，IDF 100A：1987培养基的营养更全面，利于细菌的生长繁殖，对检出率的提高起了主要作用，而且其培养基颜色浅，易于计数，流动性好，容易与样品稀释液混匀。说明在菌落计数中，IDF培养基要优于平板计数琼脂（PCA）培养基。
2.4.2 培养温度
由于各种食品中所分布的细菌种类不同，其最佳检测温度也不尽相同[8]。实验采用的三种检测标准中使用的培养温度分别为37、30、35℃。其中，GB/T 4789.2—2010和FDA BAM—2001的主要区别在于计数范围和培养温度，由表2结果表明，35℃条件下菌落总数的检出率高于37℃，35℃更适于原料乳中细菌的生长。
2.4.3 培养时间
从培养周期看，培养时间越长，同类别微生物生长繁殖的代数越多，数量也就越多。GB/T 4789.2—2010和FDA BAM—2001的培养周期短为48 h，而IDF 100A：1987为72 h，这可能也是表3结果中IDF 100A：1987检出率高于GB/T 4789.2—2010和FDA BAM—2001的原因。但培养周期太长，不利于快速、大批量的检测。
2.4.4 稀释液
培养介质对细菌增长有一定影响，GB/T 4789.2—2010和FDA BAM—2001采用的稀释液为磷酸盐缓冲溶液或生理盐水，IDF 100A：1987采用蛋白胨溶液。蛋白胨溶液中含有较多有利于细菌生长的营养物质，并且对食品中已受损的细菌细胞有一定的保护作用[9]，而且检样稀释至倾注平板在15 min内完成，时间较短，对菌落检出率的影响可忽略不计。因此在制备样品稀释液时，采用蛋白胨溶液要比磷酸盐缓冲液或生理盐水更能提高菌落总数的检出率。
2.4.5 计数范围
计数范围的选择在很大程度上也会影响检出率。理论上讲，计数范围越小，会使检测结果偏小。三种检测方法的计数范围分别为：GB/T 4789.2—2010 30～300 CFU，IDF 100A：1987 10～300 CFU，FDA BAM—2001 25～250 CFU。试验结果显示，IDF 100A：1987的检测结果最大，与预测结果基本吻合。
3 小结
原料乳中菌落总数的测定方法有多种，而对于培养温度的选择应选择兼顾体温型和室温型两类微生物，国外采用35℃是偏体温型，采用30℃是偏室温型，而国内统一选择37℃应用于所有食品[10]，在一定程度上不利于微生物的检出。通过对GB/T 4789.2—2010，IDF 100A：1987和FDA BAM—2001中规定的菌落总数测定方法进行比较分析发现，三种标准的测定结果间存在显著性差异，其中，IDF 100A：1987方法中培养基成分的营养全面，检出率最高，但检验周期较长，不利于快速检测；在培养时间相同、培养基成分相同时，FDA BAM—2001的检出率高于GB/T 4789.2—2010，说明培养温度为35℃时，更有利于原料乳中细菌的生长，便于菌落总数的检出；在原料乳的检测上，GB/T 4789.2—2010的检出率略低于IDF 100A：1987和FDA BAM—2001。
