兽用抗生素残留对环境中细菌耐药性影响的研究进展

郭瑞鹏，吴银宝，2，3＊

（1.华南农业大学 动物科学学院，广东 广州510642；2.华南农业大学 农业部生态农业重点开放实验室，广东 广州510642；3.广东省高等学校农业生态与农村环境重点实验室，广东 广州510642）

抗生素在治疗、预防畜禽疾病和促进畜禽生长等方面发挥着积极作用，同时其在生物体和环境中残留所引起的负面效应也日益增大。兽用抗生素进入畜禽体后，经体内代谢，其原形及其代谢产物一方面会在畜禽机体内残留；另一方面会随着畜禽排泄物进入环境，对环境生物构成威胁［1］。已有的研究认为，环境中的兽用抗生素残留除影响微生物数量及功能外，还可能诱导微生物产生并传播耐药基因，改变环境微生物的结构，使环境中的耐药微生物成为优势菌群，而环境介质如土壤、水体中耐药微生物种类与数量的不断增加可能会对人类以及动物健康造成威胁［2］。因此本文综述了兽用抗生素残留对环境中细菌耐药性影响的相关研究，为该领域的研究提供参考。

1 抗生素残留及细菌耐药性

畜牧养殖业中兽用抗生素的广泛应用被认为是环境中兽用抗生素残留的主要来源之一［3］。已有的研究表明，兽用抗生素很难被动物完全吸收并分解，大约有30%～75%的抗生素以母体化合物的形式随粪尿排出体外［4］。同时值得注意的是，兽用抗生素的大量应用还导致了微生物耐药性的产生与传播，造成微生物耐药基因的出现。目前，微生物中含有的耐药基因已被列为一种新型的环境污染物［5］，耐药基因的存在及其在环境中的传播都会对环境微生物区系产生较大影响，引起微生物群落结构变化，进而影响所在生态系统的功能。

1.1 环境中的兽用抗生素残留现状

畜禽粪便产量大，超过80%的畜禽粪便不经过综合处理直接排放到环境当中［6］。Wei等［7］研究发现，在养殖场污水中，环丙沙星、恩诺沙星以及氟苯尼考的含量分别为3.35μg／L、1.09μg／L和0.95 μg／L。Ho等［8］研究发现，肉鸡粪便中氟甲喹的含量最高可达1331.4μg／kg DM，土壤中多西环素含量最高可达78516.1μg／kg DM 畜禽粪便施用于农田或者进入水体后，会造成环境中相应抗生素的残留和累积。Hamscher等［9］应用液质谱联用的方法测定地表土壤和地下水中抗生素的残留情况，结果发现部分土壤样品金霉素和磺胺地托辛的含量分别为13.1μg／kg和7.7μg／kg，15个水样中有4个测到磺胺嘧啶（0.23μg／L）磺胺地托辛（0.14～0.88 μg／L）。Wei等［7］在采集的河水样品中发现环丙沙星、恩诺沙星以及氟苯尼考的含量分别高达5.93 μg／L、4.24μg／L和2.40μg／L显著高于采集的养殖场废水中抗生素含量。

1.2 环境中细菌耐药性现状

外界环境作为承载细菌等微生物的储存媒介之一，动物体内的耐药菌进入外界环境必然会引起外界环境中土著细菌耐药性的产生。姚美玲［10］对鸡、兔舍舍内外不同高度处空气中的大肠杆菌耐药性检测表明，畜舍及其周围环境中的气载大肠杆菌耐药性严重，且以多重耐药为主。Vanessa等［11］研究了土壤中480种不同芽孢微生物，发现每种微生物对7种以上抗生素产生了耐受性，并指出土壤已经成为一个巨大的耐药基因库。耐药性的产生导致细菌产生耐药基因，而耐药基因的产生又会反过来调控耐药性。在动物粪便中、施用粪便的土壤中、畜禽粪便堆肥、地表水以及地下水等多种环境介质中众多的学者均检测到了耐药基因的出现，而且，耐药基因出现的种类并不单一，常常是多种耐药基因同时检测到。Mccauley等［12］在猪场废水泥浆中，检测到多种四环素类耐药基因（tet）的出现。Rahman等［13］研究发现在海洋沉积物中，96%的耐药菌株含有tet基因。Hoa等［14］在鱼塘、虾池中检测到磺胺类耐药基因sul1、sul2、sul3的出现，这可能与来自于猪场的废水有关。

2 抗生素耐药性的产生及传播途径

2.1 耐药性的产生

细菌耐药性的产生一般分为两个方面：一是固有耐药性，来源于细菌本身携带的耐药基因［15-17］。Akinbowale等［18］在检测对土霉素产生耐药性菌株的耐药基因时发现，有75%的细菌含有tet基因，其中50%为tet（M），45%为tet（E），35%为tet（A），15%为tet（D）。二是获得性耐药性，主要是由于基因突变、携有耐药基因的质粒在细菌间的转移、外源性DNA掺入重组［12］。有报道称大肠杆菌对喹诺酮类药物产生耐药性的机制通常是由编码DNA螺旋酶或拓扑酶IV的染色体基因突变和／或导致药物转运改变的突变引起的［19］。磺胺类药物的耐药基因大多出现在不动杆菌的质粒上，芽孢杆菌是携带tet基因的优势菌种［10-11］。获得性耐药性的产生，另外一个来源是抗生素的大量使用，抗生素的选择性作用促进了细菌耐药性的产生。研究发现，随着恩诺沙星在肉仔鸡中的使用，在5 d内，最小抑菌值（MIC）从0.25μg／m L增加到32μg／m L［20］。

单个细菌产生的耐药性效果较小，但是由于菌群数量大，因此细菌耐药性经常发生。动物肠道内产生耐药性的细菌和经体内代谢的兽用抗生素原形或者代谢产物经动物粪便排放到外界环境中均能引起细菌耐药性的产生以及传播。抗生素的使用以及在环境中的残留，对于敏感性较高的细菌来说会抑制其生长甚至杀灭细菌，而高耐受性细菌会存活下来，并且发展成为优势菌群。

耐药性的传播除了受到菌群数量的影响之外，外界环境变化以及畜禽种类也会对其产生影响。有学者发现当断奶的小牛日粮中添加四环素时，夏季四环素类耐药基因的含量要比秋季低10～100倍［21］。Chen等［22］通过检测猪粪和牛粪中耐药基因的含量时发现，猪粪中红霉素耐药基因（erm）基因的含量水平高于牛粪。

2.2 耐药性的传播途径

耐药性的传播类型可以分为两种：个体耐药菌的垂直传播和耐药基因的水平传播。两者之中以耐药基因的水平传播方式更为普遍。细菌的质粒一般都携带有耐药基因，耐药基因可通过转化、接合、转导作用在微生物种内、种间等进行传递转移。通过这种水平转移，细菌的耐药性扩散迅速、广泛，耐药株可自身克隆扩散，也可与敏感株进行遗传物质交换。Simjee等［23］在鸡粪肠球菌中检测到了可移动遗传子Tn196和信息素诱导质粒。Jacobs［24］在对37株气单孢菌的耐药性进行检测时发现，有27株菌携有耐药质粒，其中14株携有多重耐药性质粒，在对质粒携带的多重耐药性整合因子class1进行PCR扩增之后，检测到其中含有多种不同的耐药基因。Lin［25］通过调查密苏比河耐药基因情况时发现，58%的多重耐药菌拥有整合子I，在整合子包含的耐药基因中，β-内酰胺酶类耐药基因占44%，氨基糖甙耐药基因16%，磺胺类耐药基因和季胺盐类复合物耐药基因占24%。

不同类药物的耐药基因之间会产生相互影响。Chen等［22］研究发现，在畜禽粪便以及曝气池中四环素类药物耐药基因（tet）含量水平同大环内脂类耐药基因（erm）之间存在正相关。由此可见，耐药基因之间存在着可能的协同作用也是导致耐药基因在环境中数量不断增多进而引起耐药性广泛传播的原因之一。

3 抗生素残留对环境中细菌耐药性的影响

兽用抗生素的使用不仅造成动物体内微生物产生耐药性，而且其随畜禽粪便进入土壤等环境中，会影响昆虫等动物的生长、导致环境微生物群落结构发生变化，降低环境中微生物的活性［26］，引起环境中微生物耐药性的产生并引起耐药性传播，进而引起耐药性细菌以及耐药基因含量的增加［21］，打破了土著微生物群落的生态平衡。

畜牧养殖业中过量使用兽用抗生素，畜禽粪便不经过无害化等有效手段进行处理便进入水体、土壤等环境中，导致环境中细菌耐药性的产生及传播现象越来越严重。

3.1 畜禽粪便中的细菌耐药性

畜禽粪便是兽用抗生素进入环境中的一个中介途径，畜禽粪便中耐药性细菌的数量对于环境中耐药性的传播有着显著的影响，畜禽体内微生物所产生的耐药性能随粪便进入环境，并将耐药基因传播给环境微生物。因此作为兽用抗生素进入环境的一个重要媒介，有必要对畜禽粪便中残留的兽用抗生素对细菌耐药性的影响进行研究。Pei等［27］在添加了强力霉素、磺胺甲恶唑、泰乐菌素和莫能菌素之后，检测曝气池奶牛粪便中耐药基因的变化情况，结果发现四环素耐药基因和磺胺类耐药基因先上升后回到初始水平，大环内脂类耐药基因ere（A）和msr（A）含量则一直持较低水平，尽管添加了杀虫剂，但是tet基因的含量一直增加。四环素类药物相对其他兽用抗生素在畜牧生产中应用的更为广泛，这也可能是由于抗生素的长期性选择压力作用，使得tet基因水平传播更为广泛，含有tet基因的细菌更能耐受四环素类药物。细菌耐药性以及耐药基因的产生是由于抗生素的长期选择性压力造成的。Schwaiger等［28］研究发现，随着四环素浓度的增加，粪便细菌中tet（L）和tet（M）同时检测到的几率也就越大。畜禽粪便中细菌的耐药性大多是来源于动物肠道中具有耐药性的微生物。

3.2 水体中的细菌耐药性

残留的兽用抗生素排放到水体中会导致水中细菌耐药性基因的含量增加。邹世春等［29］对河水中不同地点抗生素细菌耐药性进行研究时发现，研究的9个样品中有8个样品对磺胺二甲嘧啶有耐药性，5个样品对四环素有耐药性，7个样品对红霉素有耐药性，其中5个样品有对3种抗生素均表现耐药性，并发现sul1和sul2磺胺抗性基因的含量水平与水中磺胺的含量分布具有一定的相关性，说明外源性抗生素对河流的污染是诱导抗性基因产生的重要因素。同样，Luo等［30］研究发现sul1和sul2等磺胺类耐药基因同水体中（海河）磺胺类药物的含量称显著正相关，并指出磺胺类药物大多来自于畜牧养殖业［31］。水产养殖中渔药多以拌料或直接投入水体的方式给药，药物经动物排泄最终进入土壤和表层水体中［32］，部分动物粪便也可直接应用于水产养殖中。这两种方式都造成药物在表层水体等环境中残留，药物在环境中残留将诱导细菌产生耐药性。有报道发现鱼牧混合鱼塘由于畜牧养殖中动物粪尿等排泄物和饲料流入鱼塘，不仅污染鱼塘环境，同时诱导水源细菌耐药性的产生，导致混合鱼塘细菌耐药率明显高于不添加粪便的鱼塘［33］。易秀丽等［34］发现不同水源粪肠球菌耐药性有所不同，粪肠球菌耐药性水平的高低同水环境中抗生素的残留量成正相关，抗生素污染程度越大，耐药性越高。

3.3 土壤中的细菌耐药性

畜禽粪便还田利用，残留的兽用抗生素会导致土壤环境中耐药性的传播。土壤中细菌耐药性的产生在绝大多数情况下是直接在畜禽粪便中产生然后通过粪便直接在引起细菌耐药性在土壤中的传播。土壤环境中细菌耐药性的产生同残留的兽用抗生素浓度相关，兽用抗生素残留的不断累积会导致细菌耐药性的产生。Sudeshna等［35］发现含有金霉素的粪便施用到土壤当中，土壤中耐金霉素的细菌含量显著增加。适量的施用粪肥并不会显著导致耐药菌耐药性的扩散，但是随着施用量得增加耐药性扩散趋势就会增加。Sengelova等［36］研究发现土壤中四环素耐药菌的发生率随施肥量增加而提高，表明耐药菌可以随动物的粪便直接扩散土壤中，导致耐药性在土壤中的传播。Esiobu等［37］在将含有兽药残留的奶牛粪便施用到土壤中，结果发现细菌对于盘尼西林、四环素和链霉素的耐药性增加了70%。兽药残留对土壤细菌耐药性的影响不仅与残留浓度有关，同粪便的施用时间也存在一定关系。施用时间越长，细菌耐药性也就越大，耐药菌株的数量也就会越多［36］。有学者研究发现，堆积过含有耐药基因鸡粪的土地，在移除鸡粪两年之后，土壤样品中检测到少量耐药基因以及相关基因转座子的存在［38］。

由于人类以及动物活动的影响，各种环境之间交互性逐渐加大，这就更加促进了耐药性在水体、土壤、空气等环境介质的传播。细菌耐药性的传播不再只在单一的环境介质中进行。随着畜禽粪便以及其他含有兽用抗生素残留的媒介在环境中的流通，不同环境之间细菌耐药性以及耐药基因也会产生交互影响，尤其是耐药性在不同介质致病性细菌之间的传播，对于人类和动物的健康必然会造成危害。

4 研究展望

对于抗生素的使用同耐药性的选择之间的关系研究较多，然而关于耐药性表现型与基因型的研究缺乏适当的测定方法。有研究发现，同一环境下，粪肠球菌和金黄色葡萄球菌耐药性的表现型和基因型出现差异，部分是因为存在一些防止移动的DNA因子进行交换的障碍［23］。不同环境介质中细菌耐药性及其抗性基因的种类数量有所不同，应该建立系统的测定方法，同时应该考虑环境因子与微生物耐药性之间的关系。

许多微生物的抗性基因常与一些可移动的基因元件相关联，这些基因元件往往携带有其他种类的抗性基因，比如重金属，这就使得微生物除了具有耐药性之外还产生多抗性，因此应该从整体的水平对环境中微生物的抗性进行研究。

目前国内外有关细菌耐药性的调查研究大多集中在生活饮用水、医院周围和食源性病原菌中，对于环境中细菌耐药性未引起足够的重视，有关于不同自然环境中细菌耐药性传播的规律尚乏研究。环境介质中细菌耐药性相对于医院和食源性病原菌的耐药性情况更为复杂，而土壤和水体等作为环境中细菌耐药性的主要传播途径，更应该受到严格的监测。

［1］ Dasong Lin，Qixing Zhou，Yingming Xu，et al.Physiological and molecular responses of the earthworm （Eisenia fetida）to soil chlortetracycline contamination［J］.Environmental Pollution，2012，171：46-51.

［2］ Ajit K Sarmah，Michael T Meyer，Alistair B A Boxall.A global perspective on the use，sales，exposure pathways，occurrence，fate and effects of veterinary antibiotics（VAs）in the environment［J］.Chemosphere，2006，65：725-759.

［3］ Daniel D Snow，Shannon L，Bartelt-Hunt，et al.Detection，Occurrence and Fate of Emerging Contaminants in Agricultural Environments［J］.Water Environment Research，2008，80（10）：868-897.

［4］ Diaz Cruz M S，Barcelo D.Determination of antimicrobial residues and metabolites in the aquatic environment by liquid chromatography tandem mass spectrometry［J］.Analytical and Bioanalytical Chemistry，2006，386（4）：973-985.

［5］ Chen J，Fluharty F L，St-Pierre N，et al.Technical note：Occurrence in fecal microbiota of genes conferring resistance to both macrolide-lincosamide-streptogramin B and tetracyclines concomitant with feeding of cattle with tylosin［J］.Journal of Animal Science，2008，86：2 385-2 391.

［6］ 李兆君，姚志鹏，张 杰，等.兽用抗生素在土壤环境中的行为及其生态毒理效应研究进展［J］.生态毒理学报，2008，3（1）：15-20.

［7］ Wei R C，Chen M ，Wang R，et al.Occurrence of Ciprofloxacin，Enrofloxacin，and Florfenicol in Animal Wastewater and Water Resources［J］.Journal of Environmental Quality，2012，41（5）：1 481-1 486.

［8］ Hoa Y B，Mohamad Pauzi Zakariaa，Puziah Abdul Latif，et al.Simultaneous determination of veterinary antibiotics and hormone in broiler manure，soil and manure compost by liquid chromatography-tandem mass spectrometry［J］.Journal of Chromatography A，2012，1262：160-168.

［9］ Hamscher G B，Priess H N.A survey of the occurrence of various sulfonamides and tetracyclines in water and sediment samples originating from aquaculture systems in Northern Germany in summer 2005［J］.Archiv Fur Lebensmittelhy Giene，2006，57（4）：97-101.

［10］ 姚美玲.ERIC-PCR对畜禽舍气载耐药大肠杆菌来源及向周边环境传播的检测［D］.山东泰安：山东农业大学，2007.

［11］ Vanessa M，Costa D，Katherine M，et al.Sampling the Antibiotic Resistome［J］.Science，2006，311（5759）：374-377.

［12］ Macauley J J，Adams C D，Mormile M R.Diversity of tet resistance genes in tetracycline-resistant bacteria isolated from a swine lagoon with low antibiotic impact［J］.Canadian Journal of Microbiology，2007，53（12），1 307-1 315.

［13］ Rahman M H，Nonaka L，Tago R，et al.Occurrence of two genotypes of tetracycline（TC）resistance gene tet（M）in the TC-resistant bacteria in marine sediments of Japan［J］.Environ Sci Tech，2008，42：5 055-5 061.

［14］ Hoa P T P，Nonaka L，Viet P H，Suzuki S.Detection of the sul1，sul2，and sul3 genes in sulfonamide resistant bacteria from wastewater and shimp ponds of north Vietnam［J］.Sci Total Environ，2008，405：377-384.

［15］ 马永生，徐永平，金礼吉，等.饲用抗生素细菌耐药性的研究进展［J］.中国饲料，2005（12）：5-7.

［16］ Rustam I Aminov，Roderick I Mackie.Evolution and Ecology of antibiotic resistance genes［J］.Fems Microbiol Lett，2007，271（2）：147-161.

［17］ Yang Wang，Cong-Ming Wu，Li-Ming Lu，et al.Macrolidelincosamide-resistance phenotypes and genotypes of Staphylococcus aureus isolated from bovine clinical mastitis［J］.Veterinary Microbiology，2008，130：118-125.

［18］ Akinbowale O L，Peng H，Barton M D.Diversity of tetracycline resistance genes in bacteria from aquaculture sources in Australia［J］.Journal of Applied Microbiology，2007，103（5）：2 016-2 025.

［19］ 肖 方，李新生，张素梅，等.质粒介导的喹诺酮类耐药基因在鸡源大肠杆菌中的流行［J］.华北农学报，2010，25（1）：222-225.

［20］ Patrick F，McDermott，Sonya M，et al.Ciprofloxacin Resistance in Campylobacter jejuni Evolves Rapidly in Chickens Treated with Fluoroquinolones［J］.J Infect Dis，2002，185（6）：837-840.

［21］ Peak N，Knapp C W，Yang R K，et al.Abundance of six tetracycline resistance genes in wastewater lagoons at cattle feedlots with different antibiotic use strategies［J］.Environmental Microbiology，2007，9（1）：143-151.

［22］ Chen J，Yu Z T，Michel F C，et al.Development and application of real-time PCR assays for quantification of erm genes conferring resistance to macrolides-lincosamides-strepto-gramin B in livestock manure and manure management systems［J］.Applied and Environmental Microbiology，2007，73（14）：4 407-4 416.

［23］ Simjee S，McDermott P F，White D G，et al.Antimicrobial Susceptibility and Distribution of Antimicrobial-Resistance Genes Among Enterococcus and Coagulase-Negative Staphylococcus Isolates Recovered from Poultry Litter［J］.Avian Diseases，2007，51（4）：884-892.

［24］ Jacobs Liezl，Chena Hafizah Y.Characterization of integrons and tetracycline resistance determinants in Aeromonas spp.isolated from South African aquaculture systems［J］.International Journal of Food Microbiology，2007，114：295-306.

［25］ Lin J，Biyela P T，T Puckree.Antibiotic resistance profiles of environmental isolates from Mhlathuze River，KwaZulu-Natal（RSA）［J］.Water Sa，2004，30（1）：23-28.

［26］ Kotzerke A，Sharma S，Schauss K，et al.Alterations in soil microbial activity and Ntransformation processes due to sulfadiazine loads in pig-manure［J］.Environmental Pollution，2008，153：315-322.

［27］ Pei R，Cha J，Carlson K H，et al.Response of antibiotic resistance genes（ARG）to biological treatment in dairy lagoon water［J］.Environmental Science＆ Technology，2007，41（14）：5 108-5 113.

［28］ Karin Schwaiger，Katrin Harms，Christina H L，et al.Tetracycline in liquid manure selects for co-occurrence of the resistance genes tet（M）and tet（L）in Enterococcus faecalis［J］.Veterinary Microliology，2009，139：386-392.

［29］ 邹世春，朱春敬，贺竹梅，等.北江河水中抗生素抗性基因污染初步研究［J］.生态毒理学报，2009，4（5）：655-660.

［30］ Yi Luo，Daqing Mao，Michal Rysz，et al.Trends in antibiot-ic resistance genes occurrence in the Haihe River［J］.China ES＆T，2010，44，7 220-7 225.

［31］ Yi Luo，Lin Xu，Michal Rysz，et al.Occurrence and Transport of Tetracycline，Sulfonamide，Quinolone，and Macrolide Antibiotics in the Haihe River Basin［J］.China ES＆T，2011，45（5），1 827-1 833.

［32］ 彭金菊，马 驿，徐础敏，等.恩诺沙星诱导水生细菌产生耐药性最低浓度选择［J］.中兽医医药杂志，2009（3）：5-7.

［33］ Petersen A，Andersen J S，Kaewmak T，et al.Impact of in tegrated fish farming on antimicrobial resistance in a pond environment［J］.Applied and Environmental Microbiology，2002，68：6 036-6 042.

［34］ 易秀丽，俞道进，黄一帆.3种不同水源粪肠球菌耐药情况［J］.福建农林大学学报：自然科学版，2008，37（1）：92-95.

［35］ Sudeshna Ghosh，Timothy M LaPara.The effects of subtherapeutic antibiotic use in farm animals on the proliferation and persistence of antibiotic resistance among soil bacteria［J］.The Isme Journal，2007（1）：191-203.

［36］ Gitte Sengel∅v，Yvonne Agers∅a，Bent Halling-S∅rensen，et al.Bacterial antibiotic resistance levels in Danish farmland as a result of treatment with pig manure slurry［J］.Environment International，2003，28：587-595.

［37］ Esiobu N ，Arments L ，Ike J.Antibiotic resistance in soil and water environments［J］.Int J Environ Health Research，2002，12：133-144.

［38］ You Y Q ，Hilpert M ，Ward M J.Detection of a Common and Persistent tet（L）-Carrying Plasmid in Chicken-Waste-Impacted Farm Soil［J］.Applied and environmental microblology，2012，78（9）：3 203-3 213.