退变颈椎椎间盘纤维环成纤维细胞成骨分化与颈椎病

姚 承，卢旭华

颈椎病是一种缓慢进展的退行性病变。现有研究认为该病是以颈椎椎间盘退变为基础病理进而造成椎间隙变窄、关节囊松弛以及进行性骨赘形成，进而分别刺激、压迫相邻的颈脊神经根、颈脊髓，椎动脉、椎旁交感神经等神经血管组织所致。

前人对于颈椎椎间盘的退变研究主要集中在髓核，对于颈椎椎间盘纤维环退变后的转归及加速退变诱因、是否参与椎体后缘骨赘形成尚无定论。以往研究证明，成纤维细胞在诱导因素下具有成骨能力，并可以转化为成骨细胞［1］。本文拟对颈椎椎间盘纤维环的退变性成骨分化及其与颈椎病关系的研究做一综述。

1 牵张力对颈椎椎间盘纤维环成纤维细胞向成骨细胞转化的影响研究

一般认为在低头屈曲工作状态下颈椎应力较大造成退变加速。但高牵张力作用下颈椎椎间盘纤维环中的成纤维细胞会发生什么样的转归化生尚不明确。

目前对于牵张力作用下成纤维细胞的转归有过多种多样的研究，王永等［2］实验表明，一定力值范围内的机械牵张力能促进成纤维细胞增值，且细胞增殖与力值呈相反关系。然而超过范围的过大力值(3 000 με)的牵张力则明显抑制成纤维细胞增殖。该结果得到相关动物实验的支持。吴汉江等［3］的实验也表明适当的牵张力刺激有利于改善细胞功能和活性，但是长期和较大的牵张力会引起细胞损伤，反而阻碍软骨细胞的分化增殖抑制细胞的活力。同一大小的牵张力对不同年龄的兔鼻软骨细胞的增值活性变化的影响不同，牵张力对于新生兔体外培养的兔鼻软骨的促增值作用更加明显。可以理解为新生兔鼻软骨细胞较之6 周龄兔兔鼻软骨细胞在牵张力刺激下产生的具有促进增值作用的细胞因子的能力更强，因此对牵张力的刺激更加明显。而在骆泉丰等［4］的实验中未观察到牵张力直接引起成纤维细胞向成骨细胞的转化。在以前的实验中，曾观察到牵张力可以刺激成骨细胞分泌骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein 2，BMP-2)以及转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)，这2 种因子在诱导成纤维细胞向成骨细胞转化过程中起到非常重要的作用。因此，牵张力对成纤维细胞向成骨细胞转化可能起到一个间接的促进作用。大量实验表明适当的应力载荷可以促进成骨细胞内的力敏感基因表达［5］。如早期的反应基因、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)和骨钙素、BMP 及其受体、胶原蛋白、骨桥蛋白(osteopontin，OPN)、TGF-β、碱性成纤维细胞生长因子(basylous fibroblast growth factor，bFGF)、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)、胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor，IGF)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、血小板衍生因子(platelet derived growth factor，PDGF)等，都在牵张成骨新骨生成过程中都扮演了重要的角色。Knoll 等［6］研究结果显示，牵张力数值过大或者过小都难以获得促进细胞增值的最佳效果。低水平的牵张力不足以维持骨的形成，使骨的吸收大于形成;250～2 500με 的力值可为骨组织的形成提供有效的刺激;但是当力值超过2 500με 虽然可以刺激骨形成，但是骨吸收的速度也大大加快。在以往的研究中，都得出了牵张力对于成纤维细胞可能存在间接或直接的作用，促进成纤维细胞增殖以及骨化;而牵张力过大，可能会抑制损伤细胞。但是，针对颈椎椎间盘纤维环的成纤维细胞骨化过程则缺少比较直接的实验数据，以彻底阐明在纤维环骨化过程中牵张力所扮演的角色。

2 颈椎椎间盘软骨细胞的成骨诱导作用

颈椎椎间盘由上下软骨板、中间的髓核和周围纤维环组成。那么在颈椎病发病过程中颈椎椎间盘纤维环中的软骨细胞和成纤维细胞之间是否存在相互作用、是否存在软骨细胞的成骨诱导作用以及这个交互作用是否对颈椎病的形成有促进?

纤维细胞由外周血中成纤维细胞转化而成，具有间充质干细胞的特点。近年来，骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)移植治疗软骨缺损成为研究的热点并在临床范围得到应用。Wakitani 等［7］将患者自体BMSCs 接种于胶原水凝胶并结合骨膜瓣覆盖治疗髌骨软骨缺损，术后6 个月发现关节功能显著改善。Wakitani 等［8］报道采用自体BMSCs 移植治疗12 例由骨性关节炎引起的股骨髁软骨损伤，术后42 周发现损伤部位由透明软骨与软组织填充，组织学观察与对照组无显著差异。

因此，软骨细胞具有诱导BMSCs 成骨分化的作用，而成纤维细胞作为具有BMSCs 特点的细胞，在体内会在软骨细胞诱导下产生新的成骨分化。

张伟等［9］认为，核心结合因子α1(core binding factor α1，cbfα1)在成纤维细胞成骨诱导以及成纤维细胞、软骨细胞的相互作用中起重要地位。成纤维细胞和成骨细胞和软骨细胞均来源于间充质干细胞，在内源基因的表达上具有很高的相似性，且cbfα1 在成纤维细胞中并无表达。实验证明cbfα1可能参与了软骨细胞的发育调控，有可能在体外通过影响cbfα1 从而影响软骨细胞与成纤维细胞的相互作用。Choi 等［10］认为人类组织中的纤维细胞有分化成成骨细胞和软骨细胞的潜能。研究人员把分离的纤维细胞和成骨祖细胞体外作对比，在相同的成骨培养基条件下，2 种细胞均向成骨细胞分化并伴随钙盐沉积和成骨基因上调。相反，研究人员把分离的纤维细胞和人间充质干细胞在含有TGFβ 的培养基培养，2 种细胞都向软骨细胞分化。

宇丽等［11］通过实验证明碱性成纤维细胞可以促进软骨等结缔组织细胞的有丝分裂活动，主要是通过与靶细胞上的受体结合发挥作用。而在不同来源的软骨细胞中，各种碱性成纤维细胞受体所介导的作用不同。碱性成纤维细胞在一定浓度范围内，对软骨细胞增值的刺激作用表现出量效关系。但是，当应用浓度超过其最佳浓度时，其刺激增值效果不再随剂量提高。有研究证明在单层培养条件下，碱性成纤维细胞有助于维持软骨细胞的再分化能力，能阻止去分化现象的发生。即使是在单层培养体系中已经发生去分化的软骨细胞，在转移到合适的培养体系中仍能发生再分化。刘霞等［12］在实验中证明软骨细胞与成纤维细胞在体外共培养12 周后，软骨细胞与成纤维细胞体外共培养能形成软骨样组织。阳性对照组以及共培养组均形成成熟的软骨样组织，组织学及免疫组化显示有成熟的软骨陷窝样结构及Ⅱ型胶原表达。共培养组在培养过程中稍有缩小，在复合物的周边区域形成了均质的软骨样组织，但是在近中心区域存在一定量的纤维性组。

上述文献提示:软骨细胞和成纤维细胞作为同源细胞，成纤维细胞具有成骨潜能;两者共同培养具有一定的相互作用。

3 颈椎椎间盘成纤维细胞向成骨细胞转化的研究

颈椎椎间盘成纤维细胞向成骨细胞转化的过程，在国内外都有相关研究。Nagano 等［13］等认为随着椎间盘的退变，纤维环中的成纤维细胞增生化生为软骨细胞。其增殖越过椎间盘边缘进而产生软骨内骨化形成骨赘纤维环中成纤维细胞的退变，软骨化生是椎间盘病变的病理基础。

卢旭华等［14］利用细胞体外培养技术，建立颈椎病患者的颈椎椎间盘纤维环中成纤维细胞的培养体系观察其在细胞因子重组人骨形态发生蛋白(Rh-bone morphogenetic protein 2，rhBMP2)，TNF-α培养液诱导下的成骨表现。证明颈椎椎间盘纤维环成纤维细胞存在成骨潜能。rhBMP-2 对纤维环成纤维细胞有明确的体外诱导成骨作用以及纤维环成纤维细胞的骨化在颈椎退变的病理过程中有重要作用。

而在颈椎椎间盘纤维环成骨潜能研究的动物实验中观察到:颈椎椎间隙植骨材料中单纯植入纤维环组织后在术后6 周时组织切片内有纤维软骨存在，12 周新生软骨存在。空白对照组术后6 周组织学观察无阳性染色结果［15］。因此推测，颈椎椎间盘纤维环组织的成骨形式很有可能是成纤维细胞的软骨化骨生成。

在李博等［16］的实验中证明，联合使用rhBMP2和bFGF 能够明显促进椎间盘细胞增值，提高细胞内碱性磷酸酶的活力、增加Ⅰ型胶原分泌、提高钙盐沉积程度、提高骨钙素的表达水平。RhBMP2 能够诱导未分化的间充质细胞不可逆的分化形成骨和软骨。但是rhBMP2 只是骨生成的启动因子，对已分化的成骨细胞没有进一步的促增值作用。bFGF 能够促进骨细胞的增值和分化，RhBMP2 启动骨形成过程后为bFGF 提高大量的靶细胞。但另一方面bFGF 没有异位诱导的成骨活性，rhBMP2 的成骨诱导作用又可弥补bFGF 的不足。从而使二者在生物学的功能上形成互补，加速骨诱导、骨形成的过程。Varkey 等［17］在文献中指出，体内体外的差异、培养液的成分以及细胞供体年龄、细胞因子的作用时间都能影响细胞因子的促成骨效应。

4 成纤维细胞成骨诱导分化的信号通路调控作用的研究

目前研究认为在成纤维细胞向成骨细胞分化的过程中，受到多种信号通路调控。其中TGF-β/BMPs［18］、Wnt、促分裂素原活化蛋白激酶(mitogenactivated protein kinases，MAPK)信号通路发挥了重要作用。而且通过对smad1 蛋白酶体的调节，Wnt和MAPK 信号通路可以对TGF-β/BMPs 通路进行调控，在相关信号通路的共同作用下使成纤维细胞骨化。

Jaiswal 等［19］发现，诱导成人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化时有细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)通路的激活。ERK 阻断剂PD98059 能剂量依赖性的阻断其向骨组织分化，并且出现向脂肪组织分化的倾向。P38MAPK 主要接受生理性应激、内毒素、渗透性应激、紫外线等刺激［20］。Raingeaud 等［21］以小鼠间充质干细胞为样本诱导向成骨细胞分化，分别加入ERK 以及P38MAPK 抑制剂，发现P38MAPK 的抑制剂能明显减弱小鼠间充质干细胞向成骨细胞的分化。万晓晨等［22］认为，在MAPK 通路中，ERK、Jun激酶(jun kinase，JNK)和P38 可通过磷酸化Smads控制其体内和体外的功能。MAPK 磷酸化Smad1 MH1、MH2 连接区的保守的积聚以抑制BMP 目的基因的表达。因此，FGF 或Ras 活化的MAPK 信号通路，可以间接调节BMP 通路的活性。研究表明，MAPK 样Nemo 激酶可以磷酸化果蝇的Smad，促进其出核抑制BMP 通路的活性［23］。孔维霞等［24］在实验中发现间充质干细胞在成骨分化过程中MAPK通路所包含的ERK、JNK 和p38 通路均发生活化;加入PD98059 后，ALP 的表达在诱导早期显著提高，而后无显著改变。加入JNK 2 后，不影响ALP和钙的沉积;而加入P38MAPK 抑制剂(SB203580)后，可显著抑制ALP 的表达和钙的沉积。P38 通路在间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)向成骨分化中起正调控作用，ERK 通路可能早期起负调控作用，而JNK 通路在其中未见显著作用。

成纤维细胞具有间充质干细胞的特点，上述细胞通路对成纤维细胞的成骨化生可能也存在类似的影响。

5 分析与展望

颈椎病在人群中发生率高，尤其在当今社会，由于人们生活和劳动内容的变化，发病人群趋于年轻化。随着对本病的研究不断深入，其发病机理不断不断被阐明，也不断有新的认识产生。对于造成脊髓压迫主要因素椎体后缘骨赘的形成机制研究会有助更好的预防和治疗颈椎病。

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