液体MGIT培养法在结核分枝杆菌检测中的应用评估

吴学兵，陆 彬，桂晓虹，江 渊，张国英，王 宏

(1.上海市第七人民医院检验科，上海 200137;2.上海市松江区中心医院检验科，上海 201600;3.上海市疾病预防控制中心结核病防治科，上海200336)

目前结核病的实验诊断方法以涂片抗酸染色和结核分枝杆菌培养为主，在结核分枝杆菌培养中，以固体罗氏(L-J)培养法为经典方法，但需4～8周时间，而液体培养中多需要昂贵的设备，不适合在基层医院推广，液体分枝杆菌培养管(MGIT)培养法对结核分枝杆菌培养具有操作简单、方便易行、报阳时间比固体L-J培养法短等优点，本研究将液体MGIT培养法与固体L-J培养法进行比较，以评估液体MGIT培养法在结核病诊断中的应用。

材料和方法

一、材料

1.标本来源 收集2010年11月至2011年8月上海松江区中心医院肺结核门诊和住院的疑似或确诊后治疗复诊的患者痰标本共1598例，其中828例为疑似新发患者标本，770例为已确诊后复诊的患者标本，结核病是根据卫生部发布的 WS288-2008《肺结核诊断标准》[1]中临床症状、体征及胸部影像学检查等确诊。

2.仪器与试剂 抗酸染液购自珠海BASO公司，固体L-J培养基为上海奥普生物医药有限公司生产的中性改良罗氏培养基，液体MGIT培养基为美国BD公司生产的MGIT培养管(手工法)，以上试剂均为上海市疾病预防控制中心(CDC)结核病防治科统一提供。美国BD公司BACTEC MicroMGIT荧光判读仪、Eppendorf Centrfuge 5810型离心机。

二、方法

1.标本留取 嘱患者留晨、晚间痰和即时痰3次，涂片染色操作和质控方法参照《结核病诊断实验室检验规程》[2]及文献报道[3]进行，涂片统计阴、阳性时以患者3次送检中有1次痰检阳性即统计为阳性。

2.标本前处理和分离培养 无菌取痰标本1～2 mL(送3次痰标本将其混和后再取)于50 mL带盖的尖底离心管中，先用1～2倍体积N-乙酰-L-半胱氨酸-NaOH法(NaOH-NALC)前处理液消化15～20 min，加入pH值6.8磷酸盐缓冲液(PBS)至 50 mL，3000×g 离心 15 min，再弃上清，沉淀用pH值6.8 PBS 0.7 mL制备成悬浊液，取0.1 mL沉淀物接种到中性固体L-J培养基中，同时取0.5 mL接种MGIT中，于标本接种MGIT前在每一个MGIT中加入0.5 mL营养添加剂(OADC)和0.1 mL以无菌蒸馏水溶解的杂菌抑制剂(PANTA)，2种培养管均置37℃培养箱内培养，次日起开始观察菌生长情况，L-J培养用肉眼观察，液体培养用手工MGIT荧光读数仪进行判读，2种方法所有阴性培养管继续进行培养和读管持续8周(判读仪判读时持续读管6周)。MGIT阴性培养管应在丢弃前再观察管内的混浊或小颗粒的情况，检测出的阳性培养均涂片抗酸染色确认。

3.质控 涂片染色每周用上海市临床检验中心抗酸染色阴阳性片做平行检测合格，室间质评定期随机涂片抽样送上海市CDC参加盲法复检评估，各项指标合格。固体L-J培养法和液体MGIT培养法所有阳性培养标本均送上海市CDC结核病防治科确认为结核分枝杆菌复合群。

三、统计学方法

采用PEMS 3.1医学统计软件包进行χ2检验和t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、2种培养法对分枝杆菌培养报阳时间

对疑似新发230株、复诊58株确诊的患者来自同一痰标本均出现培养阳性，其报阳时间进行比较，在疑似新发230例中，液体MGIT培养法报阳时间为 4 ～22 d[(13.63 ±7.14)d]，明显低于固体 L-J培养法[17～40 d，(28.67 ±10.04)d，P＜0.05)]。在复诊的58例中液体MGIT培养法报阳时间为12 ～33 d[(22.94 ±9.55)d]，明显低于固体L-J培养法[18～40 d，(28.53±10.40)d，P＜0.05)]，液体MGIT培养法中疑似新发和复诊患者的报阳天数差异有统计学意义(P＜0.05)，固体L-J培养法中疑似新发和复诊患者的报阳天数差异无统计学意义(P＞0.05)。

二、涂片及2种培养法对分枝杆菌阳性率和2种培养法的污染率

对1598例痰标本同时进行涂片抗酸染色法、液体MGIT培养法和固体L-J培养法检测，在阳性率上，液体MGIT培养法的总阳性率21.09%(337/1598)、疑似新发阳性率32.00%(265/828)、确诊治疗后复诊痰培养阳性率9.30%(72/770)，与固体L-J培养法总阳性率 10.51%(168/1598)、疑似新发阳性率 17.90%(148/828)，确诊治疗后复诊痰培养阳性率2.60%(20/770)以及和涂片抗酸染色法总阳性率 10.63%(170/1598)、疑似新发阳性率14.80%(123/828)比较均高(P＜0.05)，但在确诊治疗后复诊患者痰液体MGIT培养法阳性率与涂片抗酸染色法阳性率差异无统计学意义(P＞0.05);另一方面，固体L-J培养法和涂片抗酸染色法阳性率比较，除确诊治疗后复诊痰涂片抗酸染色法阳性率6.1%(47/770)比固体L-J培养法2.60%(20/770)高(P＜0.05)外，其余的固体L-J培养 法和涂片抗酸染色阳性率在总阳性率、疑似新发阳性率上差异无统计学意义(P＞0.05)。在液体MGIT培养法和固体L-J培养法污染率上，MGIT培养法污染率为6.57%(105/1598)，比固体 L-J培养法污染率[4.00%(64/1598)]高(P ＜0.05)。

讨 论

目前结核病的传播和治疗是一个世界性的难题，备受关注，结核分枝杆菌培养是结核病诊断金标准，但传统的实验室诊断如涂片抗酸染色法存在阳性率低的问题，我们之前研究初次确诊的结核病患者痰涂片抗酸染色法阳性率为39.4%[3]，且不能确诊和做药物敏感性试验，固体L-J培养法痰细菌报阳时间需4～8周，阳性率为44.3%，严重影响了患者的诊断和治疗;液体培养瓶(仪器法)需要昂贵的设备，不宜在基层医院推广，而液体MGIT培养法原理为MGIT底部包埋有荧光物质，荧光物质会随着管内氧含量的变化而发生反应，若有分枝杆菌在MGIT内生长消耗氧，管内荧光物质就会被激活，在特定光源的激发下释放荧光，只需用长波紫外灯或用手工MGIT荧光读数仪判读，操作简单、方便易行。

本研究发现，疑似新发患者标本液体MGIT培养法报阳时间为(13.63±7.14)d，固体 L-J培养法报阳时间为(28.67±10.04)d，两者比较差异有统计学意义(P＜0.05);复诊患者标本液体MGIT培养法报阳时间为(22.94 ±9.55)d，与固体 L-J培养法[(28.53 ±10.40)d]差异有统计学意义(P＜0.05)，虽复诊患者经治疗后细菌生长慢且难，液体MGIT培养法在复诊患者报阳时间上比固体L-J培养法平均可缩短1周左右。

从3种方法检出结核分枝杆菌的阳性率上可以看出，在无论疑似新发和复诊患者的阳性率对比上，初诊液体MGIT培养法阳性率为32.00%(255/828)，比涂片抗酸染色法14.8%(265/828)和固体L-J培养法的17.9%(148/828)阳性率都高(P ＜0.05)，与文献报道[4]基本一致，涂片抗酸染色法和固体L-J培养法在疑似新发患者痰培养中差异无统计学意义(P＞0.05)，与本实验室之前研究[3]基本一致，但在复诊的患者痰菌检验中，液体MGIT培养法阳性率为9.3%(72/770)，与涂片抗酸染色法6.1%(47/770)差异无统计学意义(P＞0.05)，与固体 L-J培养法的阳性率2.6%(20/770)相比较高(P ＜0.05)，其原因可能与复诊患者经抗结核治疗后一方面可能是无活性或活性差，如用药后L型的形成等因素，同时菌量少，不能或难以在一般培养基上生长，但涂片可查见，另一方面液体培养基和固体培养基营养成分和环境不一样[5-6]，同样显示了液体培养基优于固体L-J法，也说明了复检患者痰标本中结核分枝杆菌的分离培养更适于采用液体培养法。

液体MGIT培养法污染率为6.57%(105/1598)，比固体 L-J培养法污染率[4.0%(64/1598)]高(P ＜0.05)，比李静等[4]报道的 3.0%高，比国外的9.7%低[7]，在观察和分析实际操作中降低污染率的改进环节很多，如严格在配制pH值8.6 PBS上或其他添加剂上注意无菌操作，在标本处理和消化上充分震荡混匀，将黏液块打碎，所有的加样枪定期消毒，加样吸头高压灭菌和使用一次性移液管与吸管，生物安全柜内要加强消毒措施等，同时优化操作流程等都会在降低污染率上发挥一定的作用。

总之，液体MGIT培养法无论从提高阳性率、缩短报阳时间上都优于传统的检测方法，而且操作简便，不需要昂贵的设备，在基层医院易于进行操作和推广，本研究今后将在进一步控制和降低污染率上探索出更有效的措施和办法。

[1]中华人民共和国卫生部.肺结核诊断标准[S].WS288-2008，中华人民共和国卫生部，2008.

[2]中国防痨协会基础专业委员会.结核病诊断实验室检验规程[M].北京:中国教育文化出版社，2006:8-45.

[3]吴学兵，张 欢，陆 彬，等.253例729份新发肺结核病患者初次痰菌检测[J].检验医学，2010，25(9):682.

[4]李 静，桂晓虹，孙 丕，等.MGIT液体培养基检测分枝杆菌效果的评价[J].中华检验医学杂志，2011，34(2):111-114.

[5]胡忠义.我国结核分支杆菌L型实验研究现状与亟待解决的问题[J].中华结核和呼吸杂志，2002，25(6):583-585.

[6]黄燊德.肺结核患者结核分枝杆菌L型培养的临床意义[J].热带医学杂志，2006，6(5):568-569.

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