癌干细胞研究进展

贾庆华

癌干细胞是癌组织中存在的具有自我更新能力、分化潜能的细胞，是肿瘤发生、发展的关键［1］。近年来，癌干细胞学说提出由于癌干细胞在机体中快速复制，促使肿瘤细胞数量和瘤体体积扩张并侵入邻近组织及迁徙至机体其他组织器官，引起组织器官功能紊乱，最终导致机体死亡。由此可见，深入研究癌干细胞生物学特性，探索靶向治疗方法，对恶性肿瘤的治愈具有重大临床意义。本文介绍了癌干细胞特征、分选和鉴定及其在肿瘤发生发展中的作用，描述了各种癌干细胞研究进展以及临床应用，并对目前存在的问题和展望进行了探讨。

1 癌干细胞的特性

1.1 自我更新 癌干细胞通过产生和自身相似的子代细胞以维系肿瘤的持续生长［2］。癌干细胞积累了所在肿瘤的基因突变，正是这些基因突变导致了肿瘤细胞的过度增殖，乃至转移播散。现在有部分观点指出肿瘤不断生长是由于干细胞自我更新调节机制中的某些基因发生紊乱，使得肿瘤组织中具有自我更新能力的肿瘤细胞数量不断增加，肿瘤组织不断增大［3］。此外，调控癌干细胞自我更新的几个重要信号通路发挥着重要作用，如Notch、Wnt/β-Catenin、mTOR和Shh等，如果信号转导通路本身或者其中任一成员发生变化使其不正常活化时，都可能导致肿瘤的发生［4-7］。

1.2 分化潜能 癌干细胞分化潜能的重要特征与干细胞相似。癌干细胞在体内及体外均具有分化的能力，其子代细胞应呈现分化特征的表型及其相应的标志，形成新的肿瘤。前列腺癌和乳腺癌细胞系经特定干细胞标记物分选获得的癌干细胞，培养过程中加血清后发现随着细胞分化正常干细胞标记Bmil、Oct-3/4、Nanog和 CK14 表达下降，分化指标CK8表达水平上升，细胞进入分化状态［8］。

1.3 高致瘤性 癌干细胞的致瘤性因肿瘤种类不同差别较大，主要从两方面进行评价:①癌干细胞的体外克隆形成能力，即源自原发性肿瘤组织或肿瘤细胞系的癌干细胞在软琼脂或基底膜类似物上形成克隆数及其大小;②癌干细胞在免疫缺陷动物体内的肿瘤形成能力，即将分选的相同数量的癌干细胞和非干细胞分别原位或异位接种于免疫缺陷动物，观察其在相同时间内成瘤情况。Tirino等［9］发现人原发性骨肉瘤含有CD133+癌干细胞在体内显示高致瘤性，而且CD133是识别这些细胞的关键指标。

1.4 耐药性 耐药性是癌干细胞特征之一，癌干细胞耐药性的存在导致肿瘤患者化疗失败。癌干细胞细胞膜上多数表达ABC转运蛋白是一类跨膜蛋白，是多药耐药家族中重要的一员，可转运肽类、内源性脂质、核苷酸、代谢性药物、酶等。Koshiba等［10］发现ABC蛋白中的ABCG2参与异外源性物质新陈代谢的第三阶段，被认为是代谢物排出的“泵”，而且可以保护人类身体不受外源性物质侵犯。除了ABCG2药物泵是最主要的耐药方式，其他耐药机制包括癌干细胞处于静止期，DNA修复能力增强，具有抗凋亡作用，受信号转导通路的调控等。

2 癌干细胞的分选与鉴定

2.1 分选方法 目前主要根据肿瘤细胞表面膜蛋白、黏附分子及受体等的差异，通过流式细胞仪分选法和免疫磁珠分选法分选癌干细胞，或者用SP细胞分选法分选纯化癌干细胞。流式细胞仪分选利用待分选细胞结合荧光素标记抗体能力的差异或者利用外排荧光染料性质的差异，有无荧光标记的细胞引发的光电讯号不同，故带上的电荷不同而被分选［11］。免疫磁珠法分选细胞是基于细胞表面抗原能与连接有磁珠的特异性单抗相结合，在外加磁场中，通过抗体与磁珠相连的细胞被吸附而滞留在磁场，无该种表面抗原的细胞不能与特异性单抗结合，故不能被磁珠捕获而无磁性，不在磁场中停留，从而使细胞得以分离［12］。SP分选法又称侧群细胞分选法，该方法可用于表明标志物未知的癌干细胞的分离，即用结合DNA的荧光染料处理细胞，用维拉帕米阻断钙离子依赖转运泵作为对照组，利用癌干细胞可将染料泵出细胞的性质，将不被Hoechs33342染色或低染色的癌干细胞筛选出来［13］。

2.2 鉴定方法 细胞表面特异性标志是鉴定癌干细胞最重要的方法，其他鉴定方法包括溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)法、Hoechst33342染料法、克隆形成能力及异体移植实验。异体移植实验是鉴定癌干细胞的金标准［14］。此外，还有悬浮培养分选假说、抗凋亡分选假说等鉴定方法。

3 癌干细胞与肿瘤的关系

癌干细胞在肿瘤的发生发展中起关键性作用，其与肿瘤的转移、抗药性的产生以及治疗后的复发关系密切。Huang等［15］从乳腺癌中分离鉴定出一类表型特异的成瘤细胞(ESA+CD44+CD24-/Low-Lin-)，发现这类细胞在NOD/SCID鼠中可持续地形成肿瘤。癌干细胞的成功分离不仅证明了肿瘤干细胞的存在，同时也找到肿瘤恶变的根源。肿瘤转移是一个复杂的病理过程，癌干细胞是完成整个过程的重要因素。Pang等［16］研究发现，具有癌干细胞特性的 CD133+结肠癌细胞中同时表达 CD133、CD26，并且两者在原发灶及转移灶表达一致，同时也证实CD133+、CD26+细胞具有较强的侵袭性且在裸鼠体内有较强的转移能力。Wright等［17］研究发现，乳腺癌细胞中CD44+/CD24－和CD133+亚群细胞都具有癌干细胞特征。此外，趋化因子及其受体与肿瘤侵袭和转移密切相关，趋化因子及其受体的检测可能预测癌干细胞是否具有发生转移的可能性。如同时表达CXCR4和CCR7的乳腺癌可能预示会发生肺和淋巴结转移［18］，表达CXCR4的黑色素瘤与肺和肝转移相关［19］。

传统的肿瘤化疗药物只靶向正在分裂的肿瘤细胞，不能有效杀灭处于休眠状态的癌干细胞，导致肿瘤复发、转移。目前癌干细胞靶向治疗是肿瘤综合治疗的最有效手段之一，其中包括利用癌干细胞特异性的表面标志及其抗体与细胞毒物偶联进而杀伤癌干细胞，分离纯化癌干细胞并进行致死性辐射后激活其抗宿主癌干细胞的特异性免疫反应，抑制调控肿瘤生长、增殖的 Wnt、Notch、Hedgehog通路活化。此外，诱导癌干细胞分化，可以消耗其分裂潜能，从而抑制肿瘤发展。Yamashita等［20］研究发现抑瘤素M通过作用于信号转导和转录激活因子3，促进表皮细胞黏附因子的肝癌干细胞分化。Lang等［21］研究发现以微小RNA(miRNA)在胶质瘤干细胞中的特点可以研发专门针对癌干细胞的miRNA基础治疗。因此，利用miRNA靶向癌干细胞可提高抗肿瘤药物靶向治疗作用。恶性肿瘤难以根治的原因之一是癌干细胞或肿瘤中的侧群细胞(SP)表达ABCG2因而形成抗药性，导致化疗效果不理想。因此，有可能通过抑制ABCG2在癌干细胞中的表达以除去癌干细胞从而达到治愈癌症的目的。

4 各种癌干细胞的研究进展

4.1 人类白血病干细胞 白血病干细胞是存在于白血病患者体内的极少数具有自我更新和增殖能力并且能够起始于白血病的细胞。Bonnet和Dick［22］从急性髓系白血病患者中首次分离 CD34+、CD38－表型的白血病细胞亚群，真正认识到LSC产生白血病的根源。急性髓细胞性白血病各亚型白血病所得到的白血病干细胞的细胞表面抗原的表型都是CD34+/CD38－/CD71－/HLA－DR－/CD90－/CDⅡ7－/CDⅠ23+［23］。通过对白血病干细胞特异性抗原的研究可以提供白血病干细胞存在的证据，以检测微小残留病变，并通过白血病干细胞表达的特异性抗原可采取相应的靶向治疗。

目前研究最多的白血病微环境中趋化因子CXCL12/基质细胞衍生因子1-和其受体CXCR4间信号通路及黏附分子都会影响白血病干细胞归巢和黏附［24-25］。全反式维甲酸治疗急性髓细胞性白血病是诱导分化治疗白血病非常有效的治疗方法。此外，一些干细胞自我更新能力的重要调节因子和信号通路作为治疗的靶点，不仅促进白血病干细胞凋亡还能增强其对化疗药物的敏感性，如抑制核转录因子-κB(NF-κB)活性、PI3激酶、抑制细胞膜酪氨酸激酶 3(Flt3)活性［26-28］。然而，Corbin 等［29］发现携带BCR-ABL融合基因的慢性髓性白血病干细胞对伊马替尼治疗具有一定的抵抗性。虽然伊马替尼抑制BCR-ABL活性，但是无法将携带有BCR-ABL融合基因的慢性髓性白血病干细胞彻底消除。

4.2 乳腺癌干细胞 乳腺癌干细胞在乳腺癌的发生、发展以及转移、复发中有极其重要的作用，Honeth等［30］发现CD44+/CD24－细胞在基底样乳腺癌和BRCA1遗传性乳腺癌中常见，其中94%遗传性乳腺癌含有CD44+/CD24－细胞，可见该群细胞在乳腺癌的发生中发挥着干细胞样作用。CD44+CD24－是目前公认的乳腺癌标志物，还包括CD133+ 、CD133+CXCR4+ 、ALDH-1+ 等［31-32］，但特异性的乳腺癌干细胞标志物仍未发现。miRNA异常表达可以引起癌干细胞的失调，导致其不受控制的自我更新和癌演变，研究发现乳腺癌干细胞具有自身特征性 miRNAs。Shimono等［33］研究发现，miR-200c-141、miR-200b-200a-429、miR183-96-182这3群miRNAs在乳腺癌干细胞、人类及小鼠乳腺癌干细胞及胚胎癌性细胞中表达皆有所下调。

4.3 脑肿瘤干细胞 Ignatova等［34］将胶质瘤细胞置于无血清的神经干细胞培养基中培养，从中分离到具有克隆扩增能力、能够形成神经球的脑肿瘤干细胞。目前脑肿瘤干细胞鉴定主要依赖其表面标志CD133、Nestin蛋白和 ABC 转运体。Singh等［35］研究发现0．3%～25．1%的肿瘤细胞在体外培养条件下具有增殖与自我更新能力，可形成克隆性的神经球样集落，且这些细胞都表达CD133和Nestin蛋白。Liu等［36］证实CD133+脑肿瘤干细胞具有化疗抵抗性，对CD133+脑肿瘤干细胞耐药基因的深入研究进一步揭示了脑肿瘤干细胞的耐药机制。另外，通过以 Hedgehog、PTEN/PI3K/Akt、Notch 靶向的治疗途径，为脑肿瘤治疗开辟了新的思路。

4.4 胃癌干细胞 Takaishi等［37］发现人胃癌细胞株中可分离出 CD44+和 CD44－细胞亚群，将CD44+表型细胞移植入NOD/SCID鼠皮下和胃浆膜下能形成胃癌转移瘤，同时认为CD44是胃癌的癌干细胞标记分子。然而，也有人指出CD44无法作为人类胃癌干细胞的表面标志物［38］，需进一步研究胃癌干细胞特异性的标志物。目前，Katoh等［39］证实小分子化合物CXCR4的人类抗体，可靶向聚集于原发灶以及转移灶的胃癌干细胞的CXCR4上，为胃癌干细胞靶向治疗提供了新的依据。Shigdar等［40］从随机寡核苷酸库分离出一个能与肿瘤干细胞标志物EpCAM结合的RNA适体，而这种RNA适体内部能有效地结合多种人类肿瘤细胞(如乳腺癌、大肠癌和胃癌)表面的EpCAM。癌干细胞RNA适体将促进肿瘤新型靶向治疗药物的发展。

4.5 肺癌干细胞 Ho等［41］从人肺癌细胞系进行SP细胞分选，提出SP细胞可能是肿瘤细胞的来源并具有癌干细胞的特征。Eramo等［42］发现 CD133阳性细胞和Levina等［43］培养的耐药存活细胞均具有肺癌干细胞的特征，该三类细胞富集了一定程度的肺癌干细胞，进一步证明了肺癌干细胞的存在。同时，更多的研究者提出了醛脱氢酶1(ALDH1)、Oct-4、CD44等作为肺癌干细胞特异性标志物［44-46］。目前对利用肺癌干细胞治疗肺癌的研究主要集中在信号通路、基因、相关小分子等方面。肺癌干细胞相关信号通路主要有Wnt、Notch、Hedgehog及K-ras途径及相关的调节物质。另有研究证实，Rac1在肺癌干细胞的自我扩增中起重要作用，去除Rac1抑制肺癌干细胞的更新扩增能力［47］。Berger等［48］发现DOK2的缺损可导致小鼠肺癌的发生，并且DOK可抑制人肺癌细胞H1299在体外及体内的生长，说明DOK2可抑制肿瘤干细胞的扩增。

4.6 前列腺癌干细胞 目前研究证实，前列腺癌可能起源于前列腺癌干细胞，由此可知前列腺癌干细胞在前列腺癌发生、发展过程中具有重要的作用。由于前列腺癌干细胞发生异常改变而导致前列腺上皮出现基底细胞增生、良性前列腺肥大，最终转变成前列腺癌干细胞［49］。Collins等［50］从前列腺癌细胞中分离出了细胞表型为CD44+α2β1hi13±CD133+的细胞群，虽然这些细胞在肿瘤组织中所占比例较少，但它们具有分化成多种细胞类型和高度表达增殖的潜能。Patrawala等［51］发现前列腺癌中表达CD133、CD44、α2β1-integrin 和(或)CXCR4 的细胞，而且这些细胞具有干细胞的特性。

5 癌干细胞的临床应用

癌干细胞是肿瘤发生发展的根源，因此以癌干细胞特殊靶位点的目的治疗为肿瘤治疗指明了方向。目前，肿瘤的治疗已经趋向于只针对癌干细胞的药物及治疗方法，同时尽最大可能的保护正常干细胞。Gupta等［52］鉴定出了盐霉素具有抑制小鼠乳腺肿瘤生长以及减弱肿瘤细胞分化的作用，并能够导致一些与乳腺癌干细胞相关基因的表达缺失，其特异杀伤乳腺癌干细胞的能力可能约为普通抗癌药物紫杉醇百倍。也有研究人员逐步开发研究以小分子抑制剂和融合蛋白为主的靶向癌干细胞的药物［53-54］。因此，进一步通过确定癌干细胞的基因图谱及其特异性靶位，从而高效的杀灭肿瘤细胞而达到根治肿瘤的目的，是今后研究工作的新热点。

6 问题与展望

癌干细胞是肿瘤治疗后复发和转移的主要因素，所以彻底清除癌干细胞是根治肿瘤的关键。针对不同癌干细胞特征，今后癌干细胞研究需要解决的几个关键问题:①某些癌干细胞特异性分子标志物还未确定;②癌干细胞起源于正常干细胞、祖细胞还是成熟细胞基因突变;③癌干细胞纯化、鉴定和培养技术不够完善;④癌干细胞基因表达差异;⑤癌干细胞耐药和抗药机制;⑥高效靶向治疗癌干细胞又保护正常干细胞新方法的研发。随着对癌干细胞研究的深入，癌干细胞自身疑难点和与肿瘤发生发展各项机制逐步得到全新的认识。总之，癌干细胞学说对于肿瘤诊断、治疗、预后判断等具有重要意义。

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