降血脂的评价体系

葛泽河,孙师师综述,马洪波审校

(吉林医药学院营养教研室，吉林 吉林 132013)

·综 述·

降血脂的评价体系

The evaluation system of lowering blood lipid

葛泽河,孙师师综述,马洪波*审校

(吉林医药学院营养教研室，吉林 吉林 132013)

本文将降血脂评价体系进行初步分类，主要分为动物模型评价体系和体外评价体系两大类。并分别对两个评价体系进行介绍和特点总结，以展示不同评价体系在降血脂评价过程中的建立方法、评价方式及其利弊。

血脂；评价；综述

近年来，人们生活水平有了显著提高，健康问题已成为人们关注的热点。其中高血脂症在我国发病率逐年增高，成为主要威胁人类健康的疾病之一。高血脂症可引发动脉粥样硬化(AS)，造成高血压和心脑血管等疾病。因此开发各类降血脂药品、保健品、食品成为当前研究的热点。开发研究降血脂产品，离不开降血脂评价体系的建立。目前，常用降血脂效果的评价方法大致可分为两类，即降血脂动物模型和降血脂体外评价体系。在此将对两大类降血脂评价体系进行相关介绍。

1 降血脂动物模型

1.1模型建立

1.1.1材 料

降血脂动物模型的建立常采用的动物有雄性大白兔、雄性Wistar大鼠或SD大鼠等。兔是最早用于高脂血症和AS研究的动物。大鼠代谢较稳定，且血量充足，造成高血脂动物模型的成功率高。因此在降血脂保健食品和药品研究中通常采用大鼠制备高血脂模型。高莹等[1]比较了SD大鼠和Wistar大鼠的血清和肝脏制止对于高脂饲料(1%胆固醇、10%猪油和79%基础饲料)的反应。实验结果显示SD大鼠在TG增高水平上显著高于Wistar大鼠,提示SD大鼠可能是较好的高甘油三酯血症模型。也有用小鼠来制备高血脂模型，用以评价降血脂效果。虽然小鼠的代谢情况与大鼠有很大不同，但有实验证明，在降血脂保健食品功能评价实验中，用小鼠代替大鼠建立动物模型基本上是可行的。而且小鼠与大鼠相比可大大降低实验经费和饲育空间。故在降血脂功能材料的筛选等研究中，可先使用小鼠来摸索条件，再以大鼠做精准检测与评价，可大大提高实验精度[2]。此外，还有文献报道将鹌鹑、猴、鸡、鸽子以及贵州小型猪用于高血脂动物模型的建立。

1.1.2方 法

目前，降血脂评价体系中制备高血脂动物模型基本分为3类[3]。一是先天性动物模型，即通过动物幼年期的诱导高血脂症的建模方式;二是化学物质诱导的动物模型;三是通过转基因技术建立的高血脂动物模型。先天性动物模型是基于其本身发育不全或者可遗传基因突变所形成的高血脂动物模型，如出生25 d的乳幼大鼠，在不脱离母鼠乳汁喂养的前提下，由于乳汁中脂肪含量高且幼鼠甲状腺功能尚不健全等原因，导致乳幼大鼠的甘油三酯(TG)含量一般为成年大鼠的2～3倍。20世纪70年代初，度边氏发现了一种具有遗传性高脂血症的家兔，由于该种家兔携带一个可遗传的变异基因，而导致体内缺少低密度脂蛋白受体(LDL-R)，出现高脂血症，即为WHHL(Watamabe Heritable Hyperlipidemic)，与人类的家族性高脂血症(FH)相类似。所以在研究人类HF的过程中WHHL有着极为重要的作用。转基因动物模型主要采用的是小鼠，因为小鼠在遗传学上有着明确的野生品种且有多种突变型和重组型的品种。其中转基因小鼠常用于调控载脂蛋白基因的表达，其中以ApoE研究较多。3种方法中以化学物质诱导最为常用。化学物质诱导具体常用的方法有表面活性剂法、同型半胱氨法、免疫学法、转基因法及高脂饲料喂养法等[4],其中最为常用的是高脂饲料喂养法。具体方法有两种，一是将胆固醇、蛋黄粉、猪油等掺入基础饲料中，由实验动物自由采食。多数实验表明，高脂饲料喂食4～5周即可得高血脂动物模型。高奋等[5]在用兔进行高血脂症模型建立中，显示高脂饲料喂养家兔第4周时高脂组各项血脂均显著高于对照组，而到第8周各项指标与第4周无显著差异(P>0.05)。二是以高脂乳剂对实验动物进行每日灌胃，灌胃时间一般视动物类型而定。多数实验表明大鼠灌胃7～9 d，大鼠血清胆固醇(TC)、TG、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和极低密度脂蛋白胆固醇(VLDL-C)均有明显升高，即高血脂动物模型建立。此外，还有通过给小鼠腹腔注射75%的蛋黄乳剂0.5 mL建立高胆固醇血症的模型。Makoto等[6]通过给兔用静脉注射环磷酰胺(65 mg/kg)诱导兔形成高脂血症的造模方法。

1.2评价方法

降血脂评价体系应由正常对照组、高血脂动物模型组和实验组3组构成。正常对照组和高血脂动物模型组予以基础饲料，实验组予以基础饲料同时，予以待评价降血脂物质。饲育各实验组动物一定时间后，采用眶静脉或尾静脉取血，分离血清，测定血清血脂的各项指标，主要包含TG、TC、 LDL-C和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)含量变化[7]。TG和TC是血浆脂质的主要成分，但是只检测这两项是不足以反应血脂的代谢水平的。所以需要进一步测定LDL-C和HDL-C的浓度，LDL-C浓度的升高和低水平的HDL-C将加大患AS的几率。所以为较全面的测定血脂的代谢水平，以上4个指标的检测是必不可少的。也有取实验动物肝脏样品，测定肝组织超氧化物歧化酶(SOD)活力、组织中丙二醛(MDA)含量的改变[8]。SOD是超氧阴离子自由基的清除剂，可抑制自由基启动的脂质过氧化。而MDA能使膜蛋白、酶发生交联反应,使膜通透性增加，导致细胞膜结构、功能和代谢发生改变，对机体造成损害。王一心等[9]测定TC、LDL-C、HDL-C、TG时采用酶法，MDA采用硫代巴比妥酸(TBA)法；SOD采用黄嘌呤氧化酶法。张素英[10]测定TC使用的是酶比色法(CHOD-PAP)、TG使用的是酶比色法(GPO-PAP)、HDL-C使用的是磷钨酸-镁沉淀法(PTA-Mg)、LDL-C使用的是聚乙烯硫酸沉淀(PVS)。将实验组的各项指标与高血脂动物组进行比较，根据各项指标的变化所反映的血脂代谢水平，综合评价所用降血脂物质的降血脂效果。

1.3动物模型评价体系的利弊

降血脂动物模型比较符合人类高脂血症形成特点，适合于高脂血症研究，且此类评价体系的建立具有操作简单、技术方法成熟等优点。但是，由于实验动物在摄食量上不易控制，实验动物本身存在一定的个体差异，所以建立起的高血脂动物模型在血脂水平上有着较大的个体差异。刘明等[11]为减少个体间的血脂水平差异，采用了脂肪乳化剂给大鼠每日灌胃。但由于建模中大鼠容易腹泻，且脂肪乳化剂的表面张力大，造成灌胃困难，对大鼠损伤大，所以影响大鼠高血脂症的形成。此外，降血脂动物模型建立还有花费较大、实验周期长、不适宜降血脂化合物的快速筛选等不足之处。

2 降血脂体外评价体系

2.1评价体系建立

2.1.1材 料

降血脂体外评价技术目前所用材料有体外培养的各类细胞和人体内各类可发挥降脂作用的受体，以及各类参与脂代谢的酶与蛋白质等。其中细胞采用的有血管平滑肌细胞源性荷脂细胞、3T3-L1脂肪细胞[12]、结肠腺癌细胞(Caco-2细胞)等。Nagaoka等[13]采用Caco-2细胞建模，发现胰蛋白酶水解后的β-乳球蛋白多肽可明显降低Caco-2细胞对TC的吸收。受体采用的有低密度脂蛋白受体LDL-R、巨噬细胞清道夫受体(SR)与脂质代谢相关的核受体(nuclear receptor)等。LDL-R在调节LDL代谢和保持血液中TC正常浓度方面有很重要的意义。LDL-R基因的激活表达，是降低血液中LDL的一种途径。SR是吞噬细胞表面的一组异质性分子。在AS的研究中表明，SR是介导细胞摄取ox-LDL 的主要途径。核受体是一类配体依赖的转录因子。核受体家族成员众多，目前主要包括3大类：类固醇受体,非类固醇激素受体,孤儿核体。大量研究表明，核受体对脂肪酸和TC代谢、TC转运以及血浆载脂蛋白水平均有调控作用，通过调节核受体的活性可以实现对其目的基因表达的调控，从而达到调节脂质代谢的目的。针对各类参与脂代谢的酶与蛋白质主要包括HMG-CoA还原酶、脂蛋白脂肪酶、胆固醇酯转移蛋白等，通过对它们相应抑制剂的研究，从而对降血脂成分进行初步的筛选。例如，Tsukasa等人[14]从微生物代谢产物中发现的角鲨烯合成酶抑制剂，在降低血浆TC水平的同时还能降低血浆的TG水平。

2.1.2方 法

以体外培养细胞建立高血脂模型可以通过用基础培养基培养一段时间后，再用含高TC、油酸等培养基培养一定时间后，可得到不同高脂类型的细胞模型。牛玉存等人[15]用以上方法以HepG2细胞分别建立了高TC细胞模型和高TG细胞模型。并通过向培养液中加入5-羟胆固醇后，细胞内TC含量显著升高，3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶、固醇类元件结合蛋白-2(SREBP-2)及LDL-R表达降低，表明TC模型成功。通过向培养液中加入油酸6 h后油酸吸收率达到40%，细胞内TG有升高趋势即表明高TG模型成功。模拟人体内各类可发挥降脂作用的受体建立模型，实质上是通过诱导或抑制细胞或微生物中的该类受体相关基因的表达来建立相关受体筛选模型，用以筛选其相关受体激动剂或阻断剂。此外应用较多的还有建立体外模拟胆汁胶束的体外降血脂评价体系。江锟等人[16]通过胆汁酸结合试验验证了鲈鱼活性肽的体外降血脂活性。

2.2评价方法

将需要评价的降血脂物质加入建立的高血脂细胞培养液中，作用一定时间后，测定细胞中TC和TG的含量。人体的脂代谢中有两种最有效、最直接的降TC方式。一种是通过抑制HMG-CoA还原酶的活性来抑制胆固醇的合成[17]。二是通过提高LDLR的水平来增加LDL-C的清除率。其中血液中的LDL-C是血浆中主要携带TC的载脂蛋白，所以血液中的LDL-C浓度升高可增加心血管疾病的患病率。SREBP-2为LDL-R基因的主要调节蛋白，SREBP-2可以激活LDL-R基因的表达和胆固醇合成关键基因的表达。所以在进行体外评价时需要测定包括细胞内HMG-CoA还原酶、血液中LDL-R及SREBP-2等物质的表达情况。若细胞内TC和TG的含量较未加入该降血脂物质前有所下降，且HMG-CoA还原酶、LDL-R等较之前有所升高，则显示该降血脂物质有效。否则，显示该物质的降血脂效果尚待进一步研究确定。对于受体筛选模型，经待评价降血脂物质作用后，以荧光素酶基因为报告基础，最终通过检测荧光酶的表达量间接反应该降血脂物质的降血脂效果。通过体外模拟胆汁胶体束建立的评价体系，由于阻断胆汁酸的肝胆循环可阻断TC的重吸收，故测定胆汁酸的结合能力可用于评价物质的降血脂效果。

2.3体外评价体系的利弊

体外评价体系建立较为快速、简便，且评估结果具有很好的针对性。并且现有的体外评价方法可从脂肪/TC的几个不同代谢途径考察降血脂物质的功效，可达到降血脂成分初步筛选的目的。但体外评价体系所获结果比较单一，始终不能模拟人体内复杂的代谢环境。所以评价结果难免的存在片面性，难以完全证实被评价物在人体内也能发挥其在体外发挥同等的降血脂效果。

3 结 语

目前为止，国内常采用的降血脂评价方法主要是建立降血脂动物模型。但是，近几年也有不少研究者尝试建立各种降血脂体外评价体系，并取得了一定成果。但是无论是哪种评价体系都存在其局限性，单独采用一种评价体系所得结果存在一定局限性，所以，可以在今后的研究中考虑先用体外评价体系进行高速筛选，再用动物模型模拟人体的代谢过程，从而进行进一步的研究。这样不仅可以节约大量研究时间和经费，还可以互补不同评价体系之间的利弊，提高结果的置信度。

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R589.2

A

2013-09-06)

1673-2995(2013)06-0463-04

吉林省教育厅“十二五”科研资助项目(2013360).

葛泽河(1991-)，男(汉族)，在读本科.

马洪波(1969-)，男(汉族)，副教授，硕士.