HBsAg与抗HBs双阳患者基因突变对HBsAg抗原性改变的研究进展

王 珊 综述， 王 蕾 审校

(1.苏州大学，江苏苏州215006;2.上海中医药大学附属龙华医院检验科，上海200032)

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)可引起人类发生急、慢性HBV感染，其中乙型肝炎表面抗原(HBsAg)是诊断HBV感染的重要标志。乙型肝炎表面抗体(抗HBs)则通常在HBsAg转阴后数周，经过一段时间的窗口期血清内才会出现。抗HBs可用来预防HBV的再感染，但有赖于HBsAg与抗HBs之间的相互作用，因此HBsAg抗原性的变化可直接影响HBV感染后的诊断和治疗。但近年来国内外有关抗HBs和HBsAg共存的临床研究报告逐渐增多［1-3］，乙型肝炎患者和无症状HBV携带者均会发生抗HBs和HBsAg同时阳性的现象(简称双阳现象)。关于HBsAg与抗HBs共存机制，许多研究表明与HBsAg抗原性发生改变有关，因此我们针对HBsAg的抗原性改变与双阳现象的关系做一综述。

一、HBV基因突变与HBsAg抗原性改变

HBV基因组全长约3 200 bp，是部分双链的环状DNA，其负链核苷酸序列有4个相互重叠的开放读码框(ORF)，分别为S、C、P和X区。HBV自身编码的DNA聚合酶具有逆转录酶功能，可由前基因组RNA反转录合成子代病毒基因组，但逆转录酶缺乏3'-5'的校对功能，造成子代HBV基因组与模板之间存在一定的差异，在复制过程中极易产生突变，高复制水平的个体每天至少发生1010次点突变，其突变率远高于其他DNA病毒［4］。HBV基因突变可导致其编码区内的氨基酸发生改变。氨基酸的改变可能会影响抗原的空间构象，且氨基酸的替代位置和特性对蛋白质构象的影响也有差异。

(一)前 S区基因突变对 HBsAg抗原性的影响

S区分为前S1、前S2和S区，S区基因编码主蛋白，即HBsAg。前S2和S区基因共同编码中蛋白，前Sl、前S2和S区基因共同编码大蛋白。HBsAg由226个氨基酸组成，携带全部抗原反应性;中蛋白是在主蛋白的氨基端扩加55个氨基酸，扩加部分为前S2蛋白;大蛋白是在中蛋白的氨基端再扩加108～119个氨基酸，扩加部分为前S1蛋白。

前S区基因突变常见的为前S区的缺失。前S2起始密码缺失可使前S2蛋白不能表达。前S2突变的另一热点是前S2蛋白8～22位氨基酸附近的缺失突变，该突变可影响B细胞的识别表位。这种缺失突变株普遍存在于抗HBs阳性的慢性HBV感染者中，并成为优势株，与逃避机体免疫反应有关［5-6］。

前S1蛋白含有影响HBsAg分泌的调节序列，其第63～87位氨基酸或83～87位氨基酸缺失可下调HBsAg分泌。前S1突变株以前S1蛋白C端183位氨基酸缺失突变为多见，这种突变因影响HBsAg正常分泌，并使异常大蛋白发生蓄积而引起肝细胞病变。前S1区基因起始密码下游第230位核苷酸可因突变形成终止密码，并影响前S2起始密码，可使HBV逃避核苷类药物治疗和宿主免疫清除。

Huang等［7］对 HBsAg和抗 HBs同时阳性的慢性乙型肝炎患者前S/S区测序发现，前S区基因缺失在双阳组与单纯HBsAg阳性的对照组之间差异有统计学意义，Wang等［8］的研究也有相同的结果，即前S区基因缺失在双阳患者明显多于单纯HBsAg阳性者，因此推论可能前S区基因缺失与HBsAg和抗HBs同时存在密切相关。

(二)S区基因突变对HBsAg抗原性的影响

HBsAg由S区基因编码，其优势共同抗原表位a决定簇位于高度保守的124～147位氨基酸亲水区，是HBV各血清亚型的共同决定簇，在所有血清亚型中均存在［9］。a决定簇借2对二硫键形成2个环状结构，其独特的空间构象使其具有极强的抗原性，机体产生的保护性抗体中90%以上针对a决定簇，该部位氨基酸的替代造成的蛋白结构改变是HBsAg抗原性漂移产生的分子基础。抗原分子的立体结构是决定抗原与淋巴细胞抗原受体结合引起免疫应答的关键，也是决定抗原与抗体结合出现各种免疫反应的物质基础。若抗原立体结构发生改变，可使抗原性改变或丧失。HBsAg蛋白结构中发生氨基酸替代后，一级结构发生改变，导致维持和稳定蛋白质三级空间结构的各种氨基酸侧链之间的作用平衡被打破，而形成新的平衡和空间构象。

目前报道常见的HBV S区编码的氨基酸突变株有G145R(G→R，即甘氨酸→精氨酸)、I126T/S(异亮氨酸→苏氨酸/丝氨酸)、M133T(蛋氨酸→苏氨酸)等，其中国外文献报道最多的为145位点突变，而Wang等［3］的研究中发现C基因型乙型肝炎患者中126位点突变最常见。日本学者Ren等［10］对24例慢性感染的乙型肝炎患者的HBV S区测序发现，在7例C型患者中6例出现I126T(异亮氨酸→苏氨酸)和S143T(丝氨酸→苏氨酸)突变。模拟HBV S区a决定簇内氨基酸的3D 空间结构，结果显示126、129、140、143 位点暴露于HBsAg空间结构的表面。但他们认为I126T突变对HBsAg抗原性的影响比较大，首先I126T突变在进化树中位于基因型C分支的根源;其次蛋白或多肽的抗原性与其亲水性、等电点及构象密切相关，一般亲水性高的多肽抗原性强，亲水性低的多肽抗原性弱。由于苏氨酸与被替代的异亮氨酸化学性质差异大，苏氨酸的亲水值为－0.7，而异亮氨酸的亲水值为4.5，丝氨酸的亲水值为－0.8，与苏氨酸相近。因此I126T(异亮氨酸→苏氨酸)的突变造成HBsAg抗原性明显减弱，而S143T(丝氨酸→苏氨酸)突变使HBsAg抗原性改变不大，而且出现I126T突变的患者预后较差。

Qiu等［11］对1例C基因型的慢性乙型肝炎患者的HBsAg编码区进行聚合酶链反应(PCR)扩增，从其克隆株中选取3株126位点分别为异亮氨酸(I)、苏氨酸(T)、丝氨酸(S)的菌株，并通过定点诱导法构建126位点为丙氨酸(A)的突变株。他们发现不同的HBsAg突变株可在同一患者体内共存，且126S突变的HBsAg的抗原性明显降低，而126 I、126T、126A的HBsAg与抗体反应的水平相近。免疫荧光染色发现细胞内4种突变HBsAg的表达水平相近，因此Qiu等认为126S突变的HBsAg抗原性明显减低，可能导致慢性乙型肝炎感染中的免疫逃逸。由于I与S的亲水值相差很大，发生该突变后可使HBsAg的抗原性下降。但126T突变株抗原性的变化与Ren等［10］的研究不一致，可能与Qiu的研究例数只有1例有关。

Tian等［12］通过定点诱导法构建了HBV S基因区内 P120T、C121S、K122I、T123N、G145R 突变株并诱导HBsAg表达检测其抗原性的变化。结果显示P120T突变株与野生型HBsAg相比，与市售试剂盒反应性相近;C121S、K122I、T123N、G145R突变对HBsAg抗原性的影响较大，与抗体反应均明显降低。因此他们认为121～123位点氨基酸的改变对HBsAg抗原性有较大影响。

(三)P区基因突变对HBsAg抗原性的影响

P区是HBV基因中最长的ORF，位于第2 375-0-1 621位核苷酸之间。其开始段与C区重叠，中间与S区重叠，末段与X区重叠。P区某些位点的突变可影响HBV前基因组RNA的包装，从而影响病毒复制。

因部分P基因区与S基因区重叠，某种S或P基因的突变可引起相应重叠基因的突变［13-15］，很多研究者也已经开始关注P区突变对于S区的影响，P区的突变也可能影响HBsAg的表达、分泌和特性。Torresi等［13］研究发现拉米夫定耐药引起的突变会使HBsAg a决定簇下游相应位点氨基酸发生改变，导致HBsAg的抗原性降低，与抗体识别和结合的能力也发生改变。同样，Torresi认为核苷类似物的广泛应用可引起HBsAg突变，而疫苗诱导产生的抗体与突变抗原的结合很弱，这可能也是疫苗接种者感染的原因之一。其他研究也指出长期应用核苷类似物可引起S基因的突变［16］。国内学者对拉米夫定治疗期间隐匿性慢性乙型肝炎与HBV重叠基因突变的相关性进行研究，结果发现240例乙型肝炎患者经拉米夫定治疗36个月后16例患者HBsAg阴性，而HBeAg和HBV DNA仍呈阳性。测序发现S区a决定簇存在氨基酸突变，P区中YMDD基序出现YIDD突变。他们认为在长期拉米夫定治疗期间检测不到HBsAg，可能因HBsAg结构蛋白发生突变，与YMDD突变协同作用，使HBsAg的抗原性改变所致［17］。

Ogura等［18］对42例隐匿性慢性乙型肝炎患者HBV S基因区和与之重叠的P基因区进行了核苷酸序列分析，发现24%的患者在a决定簇发生突变，而这些突变发生后没有检测到DNA聚合酶主要催化活性区的改变，说明该突变可能不会影响P区病毒复制的功能。但有报道［19］显示重叠S基因突变会增强耐药突变株的复制活性。

(四)C区及X区基因突变对HBsAg抗原性的影响

C区包括前C区和C区。前C区基因经典的突变是ntGl 896A(即83位氨基酸突变)，可使前C区基因第28密码TGG转变为终止密码TAC，导致前C区mRNA翻译为HBeAg前体蛋白中断，HBeAg合成终止。C区最常见的突变为基本核心启动子(BCP)内ntAl 762T、ntGl 764A。这种BCP双突变影响细胞内转录因子与该区的特异性结合，可降低前C mRNA的转录效果，导致HBeAg水平下降或形成血清HBeAg阴性。关于C区基因突变对HBsAg的影响，Chen等［20］对乙型肝炎患者HBV全基因序列检测发现，双阳患者BCP内双突变高于单纯HBsAg阳性对照组，差异有统计学意义，但未见其他相似报道，需进一步研究来证实C区基因突变对HBsAg抗原性的影响。

HBV DNA ntl 763-ntl 770和ntl 753-ntl 772缺失均可使X区读码提前终止。该区编码产物HBxAg是致敏细胞毒性T细胞(CTL)攻击的靶抗原之一，血清可溶性HBxAg可调节CTL对靶细胞的免疫识别，因此 X区突变可能不利于清除HBV。至于X区基因突变对HBsAg有何影响，目前尚未见报道，值得进一步关注。

二、糖基化与HBsAg抗原性改变

蛋白翻译后的修饰状态可反映其表达细胞的胞内环境，但受病毒感染、细胞恶性化或其他环境因素的影响，胞内代谢发生改变时会导致翻译后修饰改变。糖基化是细胞表面最常见也是最重要的一种翻译后修饰，不仅增强抗原耐受蛋白酶水解能力，还可在不改变基因水平情况下，导致抗原表位结构改变，引起抗原改变或生成新表位［21］。

机体对抗原刺激的免疫应答最终均由免疫分子所介导。免疫分子包括免疫球蛋白、细胞因子、补体等。这些分子中有些为细胞膜蛋白，有些为分泌性蛋白。已知绝大部分细胞膜蛋白与分泌性蛋白属糖蛋白。因此，蛋白质的糖基化必然影响免疫分子的结构与功能，从而影响机体对抗原的应答反应。

许多病毒抗原都有糖基化的现象［22-23］。Ramanujam等［22］对风疹病毒E1蛋白3个糖基化位点N(天冬酰胺)76、N177、N209进行定点诱导突变，研究发现失去N-糖基的N76I、N209I及二者联合的突变株转染细胞后检测不到感染性的风疹病毒衣壳，而在野生型和N177I突变株感染细胞中仍可检测到，表明N76I、N209I对风疹病毒的可变性至关重要。除此之外，人流感病毒血凝素的N-糖基化位点突变分析表明N123、N149位点的糖基化在决定病毒生长特性方面起重要作用;丙型肝炎病毒E1糖蛋白在N196、N305位点的突变明显降低了E1蛋白与E2蛋白共价结合的效率;2型登革热病毒中N-糖基化位点的突变会导致其生长受到限制。

在HBV感染中，其3种表面蛋白均为被糖基化修饰的糖蛋白，他们是在人肝细胞的粗面内质网和高尔基体中被翻译后修饰而糖基化的，因此和肝细胞自身合成蛋白的糖基化修饰相似。这些糖结构不仅不能被机体免疫系统识别，还能阻碍对肝细胞膜上病毒蛋白抗原表位识别，使诱导特异性CTL应答失败，导致免疫逃逸或耐受，从而使HBV感染慢性化。HBsAg表达基因中有3个潜在的N-糖基化位点(氨基酸序列必须为NXT或NXS)，分别位于前S2开放读码起第4(随后氨基酸序列为NTT)、第59(NHS)、第146(NCT)位，已经明确第146位的天冬酰胺上连接着复杂的糖基［24］。

Wu等［25］采用定点诱导突变的方法构建了HBsAg K122I、T123N、A159G、K160N 突变株，蛋白表达后经蛋白免疫印迹法(Western blot)发现T123N和K160N突变抗原蛋白显示相对分子质量为26 000、29 000、32 000 3个条带，野生型抗原和K122I、A159G突变抗原只显示相对分子质量为26 000、29 000的2个条带，且前一组中29 000条带显色深，经过衣霉素(糖基化抑制剂)处理后，蛋白印迹中只显示26 000条带。因此他们推测26 000、29 000条带可能分别是不伴或伴糖基化的HBsAg，32 000可能是123、160位点突变后产生的额外的HBsAg糖基化形式。

刘文军等［26］利用末端重叠PCR和定点突变技术，获得了去除N-多糖结构的HBsAg S区突变基因，研究发现无糖HBsAg与糖化HBsAg的抗原表位明显不同。他们认为HBsAg的N-糖基在第146位Asn位置恰好位于a决定簇的氨基酸序列内，糖基化很可能掩盖了a决定簇。因此，当去除146位连接的糖基后，失去了原有的活性位点而暴露出新的活性位点，引起 HBsAg抗原性的改变。

三、小结

机体感染HBV后产生HBsAg，在机体的免疫压力、药物或其他因素的作用下可发生基因突变。当HBV基因发生突变时，其编码的氨基酸发生改变或影响蛋白翻译后的修饰，导致HBsAg抗原性发生改变，原先产生的抗体无法与突变后的抗原结合，出现HBsAg和抗HBs共存。至于蛋白翻译后的其他修饰，如磷酸化、甲基化等对HBsAg抗原性影响的报道目前还很少。此外，Rodriguez-Frias等［27］发现HBV氨基酸突变在慢性肝炎、肝硬化、肝癌中的发生率逐渐增高，并与疾病发展的程度相关，即疾病越严重者其氨基酸突变的数量越多。因此HBsAg突变不仅与双阳现象有关，还与疾病的进展、转归密切相关。我们应对HBsAg突变的具体机制进行更深入的探究，为临床对乙型肝炎相关疾病进行准确和及时的诊治提供有价值的信息。

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