细胞周期素D1和磷酸酶基因蛋白在喉鳞状细胞癌中的表达及与临床病理特征的关系

谷化平，黄 勇

喉癌是耳鼻咽喉头颈外科常见的恶性肿瘤［1］。现代分子生物学研究表明，喉鳞状细胞癌(laryngeal squamous cell carcinomas，LSCC)是一个多基因调控多步骤的过程，LSCC的侵袭转移是导致患者死亡的主要原因。我们采用免疫组化方法，对LSCC、不典型增生(AH)、声带息肉(VCP)和正常喉黏膜(NLM)组织联合检测细胞周期素D1(Cyclin D1)和抑癌基因—磷酸酶基因(PTEN)蛋白表达，旨在探讨这2种基因蛋白表达与LSCC临床病理参数的关系，为预测LSCC预后提供客观参考指标。

1 材料与方法

1.1 一般资料 收集解放军251医院2002年1月—2012年10月手术切除并经病理确诊的LSCC标本50例，男40例，女10例;年龄＜60岁11例，≥60岁39例。临床分期:按国际抗癌协会(UICC)1997年修订的 TNM分期标准:Ⅰ ～Ⅱ期20例，Ⅲ～Ⅳ期30例。分化程度:高分化癌22例，中/低分化癌28例;有颈部淋巴结转移29例，无淋巴结转移21例。取同期癌周AH组织20例，男15例，女5例;年龄 ＜60岁9例，≥60岁11例;VCP组织15例，男12例，女3例;年龄 ＜60岁6例，≥60岁9例，距肿物1 cm以外的NLM组织10例，男8例，女2例;年龄＜60岁2例，≥60岁8例。标本经40 g/L中性甲醛溶液固定，石蜡包埋，4μm厚连续切片。

1.2 试剂 鼠抗人Cyclin D1和PTEN单克隆抗体和EnVisionTM试剂盒为福州迈新生物有限公司提供(均为即用型)。

1.3 免疫组化染色方法 采用微波-EnVisionTM(MW-EnVisionTM)两步法:①石蜡切片脱蜡和水化后，枸橼酸缓冲液(PBS，10 mmol/L，pH 6．0)冲洗3 min，3次。②微波抗原修复:切片放入PBS液内，用微波仪辐射(170 W)5 min，保温3 min，冷却后PBS冲洗3 min，3次。③灭活内源性过氧化物:切片滴加3%过氧化物酶，室温孵育10 min，PBS液冲洗3 min，3次。④滴加第一抗体，4℃冰箱过夜，PBS冲洗3 min，3次。⑤除去PBS液，滴加EnVisionTM试剂(酶标记第二抗体)，室温下孵育30 min，PBS冲洗3 min，3次。⑥除去PBS液，滴加H2O2-DAB溶液显色3～5 min。⑦常规苏木素复染、脱水和封片。实验用已知Cyclin D1和PTEN阳性子宫内膜癌组织作阳性对照，用PBS代替第一抗体作阴性对照。

1.4 结果判断 Cyclin D1和PTEN在细胞核呈棕黄色染色为阳性。采用单盲法，每张切片在400倍显微镜下选定10个视野，计算阳性细胞的百分数。阴性(－):未见棕黄色颗粒;弱阳性(+):阳性细胞数＜25%;阳性(++):阳性细胞数25% ～75%;强阳性(+++):阳性细胞数＞75%。

1.5 统计学处理 应用SPSS 17．0软件进行统计学分析，计数资料以率(%)表示，采用χ2检验，免疫组化指标相关性采用Spearman相关分析，α=0．05为检验水准。

2 结果

2.1 Cyclin D1和PTEN在喉良、恶性病变中的表达免疫组化染色显示，Cyclin D1和PTEN位于细胞核(图1、2)。在LSCC中Cyclin D1阳性表达率显著高于AH、VCP和 NLM，差异有统计学意义(χ2=4．20、9．07、9．09，P ＜0．05)，AH 与 VCP 和 NLM 比较差异无统计学意义(P＞0．05);在LSCC中PTEN阳性表达率显著低于AH、VCP和NLM，差异有统计学意义(χ2=4．22、9．51、5．62，P ＜ 0．05)，AH 与VCP和NLM差异无统计学意义(P＞0．05)，见表1。

2.2 Cyclin D1和PTEN蛋白表达与LSCC临床病理参数的关系 Cyclin D1和PTEN蛋白表达与LSCC的性别和年龄无关(P＞0．05)，随着LSCC分化程度减低、临床分期增高和颈部淋巴结转移，Cyclin D1表达阳性率显著增高(P＜0．05)，而PTEN表达阳性率显著降低(P＜0．05)，见表2。

表1 细胞周期素D1和磷酸酶基因蛋白在喉正常及良、恶性病变组织中的表达

2.3 LSCC中Cyclin D1和PTEN蛋白表达的相关性 Cyclin D1阳性表达的31例LSCC中，PTEN表达阳性率为35．5%(11/31);Cyclin D1阴性表达的19例 LSCC中，PTEN表达阳性率为68．4%(13/19)，两者呈显著负相关(r= －0．32，P ＜0.05)。

3 讨论

细胞周期调控异常是肿瘤发生的内在原因，在细胞周期中G1→S的调控点是细胞内外信号经过传递、整合汇集到细胞核，对细胞的增殖进行调控的关键点，该点调控的异常与肿瘤的发生发展关系密切。Cyclin D1基因是一种重要的原癌基因，定位于染色体11q13，表达产物长度为120 kb，由295个氨基酸构成，是在细胞周期中含量呈周期性变化的细胞周期调节蛋白，在G1期含量最高、活性最大。Cyclin D1在 G1→S期转换中发挥着重要的正性调控作用，是与肿瘤有直接关系的肿瘤基因，其表达失控可能引起细胞异常增殖而恶变。已被证实Cyclin D1基因蛋白在人类许多恶性肿瘤中有过表达现象，并与预后有关［2-8］。本研究结果显示Cyclin D1蛋白表达阳性率在LSCC中显著高于NLM、VCP和AH，且随着LSCC临床分期增高、分化程度减低和颈部淋巴结转移其表达阳性率增高，NLM未见阳性表达，VCP和AH表达阳性率很低，且呈弱阳性，表明Cyclin D1基因的改变在LSCC发生发展过程中起着重要作用，检测Cyclin D1蛋白表达可作为判断LSCC恶性程度、临床进展和生物学行为的参考指标之一。

表2 细胞周期素D1和磷酸酶基因蛋白表达与喉鳞状细胞癌临床病理参数的关系

PTEN是迄今发现的第一个具有磷酸酶活性的抑癌基因，定位于染色体10q23上。通过结构预测显示，PTEN与细胞骨架蛋白和张力蛋白高度同源，提示PTNE可能参与细胞骨架重组并影响细胞迁移能力。有研究证实，PTEN突变或缺失可以促进血管内皮因子形成，使血管内皮细胞增殖和肿瘤微血管形成，从而使肿瘤的侵袭转移能力增强［8-11］。本研究显示PTEN蛋白表达阳性率在LSCC中低于NLM、VCP和AH，且随着LSCC临床分期增高、分化程度减低和颈部淋巴结转移其表达阳性率降低。提示PTEN的丢失与LSCC的发生、细胞恶性转化密切相关，在肿瘤转移过程中有重要的抑制作用，可能是LSCC的发生和临床进展过程中的晚期事件。在临床病理活检中检测其基因蛋白表达，可作为早期诊断、预后判断和评价肿瘤生物学行为的客观参考指标，尤其是对指导临床采用基因治疗提供依据。

近年来肿瘤分子生物学研究表明，恶性肿瘤的发生发展不仅表现为细胞增殖过强，而且与细胞凋亡减弱密切相。本研究结果显示，在LSCC中Cyclin D1与PTEN蛋白表达呈负相关。提示在LSCC发生、发展、分化和转移过程中，Cyclin D1和PTEN共同参与了LSCC的演化过程。因此，联合检测LSCC组织中Cyclin D1和PTEN蛋白表达，不仅有助于研究LSCC的发生发展，而且对辅助诊断喉良恶性病变、判断肿瘤生物学行为及预后，也有参考价值。

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