姬松茸菌丝体深层液体发酵条件的优化

王丽红， 孔 阳， 马卫红， 宇文亚焕

(陕西科技大学 生命科学与工程学院， 陕西 西安 710021)

0 引言

姬松茸又名巴西蘑菇，别名小松菇，是一种美味兼药用的蘑菇，在真菌分类上属于担子菌亚门，层菌纲，伞菌目，蘑菇科，蘑菇属[1]，含有丰富的蛋白质和糖类.近年来，国内外研究发现姬松茸子实体中含有抗肿瘤多糖、凝聚素、甾醇、核酸等生理活

性成分,在治疗癌症、糖尿病、高血脂、慢性肝炎等方面也具有显著的医疗保健作用，是一种极具开发价值的珍贵食药用真菌[2-4].姬松茸发酵菌丝体由于具有与子实体相似的营养成分、药理成分和保健功效[5-7]，并且采用深层液体发酵具有相对周期短、成本低、可以大规模工业化生产等优势,因此是目前食药用真菌实现产业化的主要方式.近年来，国内外主要侧重研究菌丝体中的活性多糖的提取工艺，但有关如何通过培养条件优化提高菌丝体胞内多糖产量这方面的报道还不多.为此，本试验主要以姬松茸的菌丝生物量和胞内多糖产量为考察指标，对姬松茸的深层液体培养条件进行了研究，为今后姬松茸多糖产业化生产奠定理论基础.

我国幅员辽阔，自然优越，蕴藏极为丰富的中草药植物资源，有学者提出中药中某些营养成分可促进药用真菌的生长或活性产物的产生，从而制得药效更佳的新型发酵制剂[8].中草药的某些成分可能使姬松茸的原有作用得到补充或增强, 因此，本文在发酵条件优化的基础上通过添加8种中草药提取液，研究对姬松茸菌丝体多糖产量的影响，以便于进一步制作出配伍更佳的新型复合发酵制剂,用于功能性食品的开发.

1 材料和方法

1.1 试验菌种

姬松茸(AgaricusblazeiMussel)

陕西省微生物研究所提供.

1.2 培养基

(1)斜面培养基:马铃薯浸出液20%，葡萄糖2%，琼脂2%，KH2PO40.2%, MgSO4·7H2O 0.1%.

(2)摇瓶种子培养基:马铃薯浸出液20%，葡萄糖2%，KH2PO40.2%, MgSO4·7H2O 0.1%，Vb110 mg/100 mL.

(3)摇瓶发酵基础培养基:玉米粉2.5%,酵母膏0.3%,KH2PO40.3%，MgSO4·7H2O 0.2%, Vb110 mg/100 mL,pH为5.0左右.

1.3 试验方法

1.3.1 姬松茸菌丝体培养

将活化好的斜面菌种用接种铲切割成黄豆大小的菌丝块，接种于摇瓶种子培养基中，25 ℃，150 r/min的振荡培养4 d后以10%接种量转接发酵瓶.250 mL摇瓶装液量40 mL，于25 ℃，150 r/min的振荡培养7 d，测定姬松茸菌丝体干重和胞内多糖含量.

(1)在发酵过程中分别考察碳源、氮源、装液量及培养温度对姬松茸菌丝生物量和多糖产量的影响.

(2)并在此基础上考察不同中草药及中草药互配对姬松茸菌丝多糖产量的影响.

不同条件各做3个平行试验，求平均值.

1.3.2 检测方法及中草药提取液的制备

(1)姬松茸菌丝生物量测定:将100 mL发酵液经4 000 r/min离心25 min后，用无菌蒸馏水冲洗菌丝滤饼3次，将其置于90 ℃电热恒温干燥箱中，烘干至恒重，用分析天平称重.

(2)多糖含量测定:准确称取干菌丝粉1.0 g，过孔径0.154 mm筛，于150 mL三角瓶中加蒸馏水25 mL，90 ℃浸提3 h，3 000 r/min离心5 min，取上清液，此操作重复1次，将2次浸提液混合，用Sevag法去除蛋白质后过滤，将滤液定容于50 mL容量瓶中，用苯酚-硫酸法[9]测定姬松茸总糖含量，DNS色法[10]测定姬松茸还原糖含量.

多糖含量=总糖含量-还原糖含量.

多糖产量=多糖含量×菌丝生物量.

(3)中草药浸汁制备:

分别装入100 mL三角瓶中于4 ℃冰箱保藏，用时取出加入发酵摇瓶中进行实体灭菌.

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

分别吸取0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4及1.6 mL的葡萄糖标准溶液于比色试管中，用苯酚-硫酸法于489 nm测定各管的吸光度.结果如图1所示.

图1 葡萄糖标准曲线

确定葡萄糖标准曲线回归方程为：y=0.011 1x+0.023 2(x表示葡萄糖浓度，y表示吸光度)R2=0.991 7.

2.2 不同碳源对菌丝生物量和多糖产量的影响

在摇瓶发酵基础培养基中分别调整碳源为淀粉、蔗糖、玉米粉和葡萄糖各2.5%，250 mL摇瓶瓶装液量40 mL，于25 ℃，150 r/min的振荡培养箱中培养7 d，菌丝生物量和多糖产量结果如图2所示.

图2 不同碳源对菌丝生物量和多糖产量的影响

由图2可知，姬松茸对碳源利用比较广泛，对各种碳源均能较好的利用.以玉米粉作碳源时，姬松茸菌丝体和多糖产量均较高，而且发酵液清亮，溶氧率高，易过滤，价格比较低廉，所以本试验中选玉米粉为最佳碳源.

2.3 氮源对菌丝生物量和多糖产量的影响

调整摇瓶发酵基础培养基各种氮源酵母膏、蛋白胨、豆饼粉和硫酸铵各0.3%， 250 mL摇瓶装液量40 mL，于25 ℃，150 r/min的振荡培养箱中培养7 d， 发酵结束考察各种氮源对菌丝生物量和多糖产量的影响.结果如图3所示.

图3 不同氮源对菌丝生物量和多糖产量的影响

由图3可知，姬松茸对有机氮源的利用总体上优于无机氮源，菌丝生物量和多糖产量都明显高于无机氮源.以酵母膏、蛋白胨和豆饼粉作氮源时，姬松茸菌丝体多糖产量都较高，但从经济方面考虑，豆饼粉具有更大的优势，所以在本试验中以豆饼粉作为最佳氮源.

2.4 摇瓶装液量对菌丝生物量和多糖产量的影响

250 mL摇瓶装液量分别为30、40、50、60和70 mL，于25 ℃，150 r/min的振荡培养箱中培养7 d，考察摇瓶装液量对菌丝生物量和多糖产量的影响.结果如图4所示.

图4 摇瓶装液量对菌丝生物量和多糖产量的影响

由图4可知，摇瓶装液量对菌丝体生物量有较大的影响，装液量为50 mL时，菌丝生物量和多糖产量均较大.装液量小时，由于该菌种的培养周期太长，后期培养基会蒸发，从而营养物质不足影响菌丝生长；当装液量增大时，会影响通风量导致供氧不足，菌丝生物量和多糖产量均减少.因此，在本试验中，选择250 mL三角瓶装液量为50 mL进行发酵.

2.5 发酵温度对菌丝生物量和多糖产量的影响

250 mL摇瓶瓶装液量为40 mL，分别20 ℃、23 ℃、26 ℃、29 ℃、32 ℃，150 r/min的振荡培养箱中培养7天，考察发酵温度对菌丝生物量和多糖产量的影响.结果如图5所示.

图5 发酵温度对菌丝生物量和多糖产量的影响

从图5可知，温度过大过小都不利于菌体生长和多糖的形成，因此确定26 ℃为最佳发酵温度.

2.6 正交试验优化培养条件

通过上述单因子实验，分别选定碳源玉米粉(A)、氮源豆饼粉(B)、装液量(C)和温度(D)4个因素，各取3个水平，进行四因素三水平正交试验，设计正交表L9(34)，从而确定最佳培养条件.结果如表1所示.

表1 正交试验结果及极差分析

由正交设计多糖产量的结果可见，各种培养因素对多糖产量的影响依次为发酵温度对该菌株的多糖产量影响最大，碳源次之，装液量对多糖产量的影响较低，氮源影响最小.确定不同因素的最佳组合为A2B2C1D2，即玉米粉3%、豆饼粉0.3%、装液量45 mL和发酵温度25 ℃.在此发酵条件下，胞内多糖产量达到7.26 g/L.

2.7 不同中草药对姬松茸菌丝多糖产量的影响

在优化后的最佳因素条件下的摇瓶发酵培养基中依次添加3%的枸杞、山药、黄芪、当归、党参、生地黄、槐米、甘草8种中草药浓缩液，250 mL摇瓶装液量50 mL，接种量为10%，pH自然，于25 ℃，150 r/min的振荡培养箱中培养7 d，其结果如图6所示：

图6 各种中草药对姬松茸多糖产量的影响

从图6可以看出在添加3%的8种中草药浓缩液时，姬松茸菌丝多糖产量有不同程度的变化，其中能够提高多糖产量的中草药及影响强弱依次为：生地黄>当归>槐米，而枸杞、山药、黄芪、党参、甘草对姬松茸多糖产量有抑制作用.最终在生地黄的影响下，多糖产量可达7.83 g/L.

2.8 中草药互配对姬松茸多糖产量影响

将生地黄、当归、槐米3种中草药浓缩液以总浓度3%的加量进行均等配比，依此添加到摇瓶发酵培养基中，研究中草药协同作用对姬松茸多糖产量影响.结果如图7所示.

图7 中草药互配对姬松茸多糖产量影响

从图7中可知此次选择的三种中草药对姬松茸多糖产量没有复方、协同作用，产量相比单独添加生地黄有所下降.有关中草药的协同促进作用还应扩大筛选范围，并根据姬松茸自然生长环境周围的中草药种类筛选到能与姬松茸相互促进的天然中草药资源.

3 结束语

(1)菌丝生物量和胞内多糖含量存在不平行性，生物量的提高不一定使有效成分多糖含量提高，多糖产量是考虑的最终因素.

(2)影响姬松茸多糖和生物量的因素较多，本试验仅对主要影响因素进行研究，确定最佳培养条件：玉米粉3%、豆饼粉0.3%、250 mL摇瓶装液量45 mL，发酵温度25 ℃，150 r/min的振荡培养箱中培养7 d，在此发酵条件下，胞内多糖产量达到7.26 g/L.

(3)利用天然中草药结合姬松茸制作出配伍更佳的新型复合发酵制剂，目前已用于功能性食品的开发.本试验通过8种中草药的添加发现生地黄对姬松茸多糖产量有一定的提高作用，多糖产量可达7.83 g/L.但生地黄、当归、槐米3种中草药互配对姬松茸多糖产量没有明显协同促进作用.有关中草药的药理作用还需进一步研究.

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