采血管中柠檬酸钠溶液浓度测定方法研究

国家食品药品监督管理总局杭州医疗器械质量监督检验中心，国家重点实验室（杭州 310009）

一次性使用真空采血管又叫一次性使用人体静脉血样采集容器，简称采血管，是用于体外诊断检查，制造商预期一次使用，含有一定真空度的商品。由盖帽、塞子、试管、添加剂或附加物等组成。根据临床需求不同，产品添加剂可以有很多种不同类型，比如添加剂EDTA 类，为血常规管，用于血液学血常规、全血检测；添加剂为肝素类，用于快速血浆生化、血流变检测；添加剂为柠檬酸钠类，有血凝管用于凝血机制（PT、APTT、凝血因子）检测，有血沉管用于血细胞沉降率检测；有促凝管用于生化、免疫、血清等检验血液样本的采集和贮存等等。这些产品具有一定的促凝或者抗凝作用，但是产品的性能怎样完全取决于产品的预置真空度和添加剂的多少。当产品的真空度确定时，完全取决于产品中添加剂的多少。本文以添加剂为柠檬酸钠溶液的血凝管和血沉管为例，介绍柠檬酸钠溶液浓度的检测方法。

柠檬酸钠溶液作为采血管的抗凝剂之一，对产品性能起着至关重要的作用，因而有必要控制真空采血管中柠檬酸钠溶液的浓度。在YY0314-2007《一次性使用人体静脉血样采集容器》附录NC 中，柠檬酸钠用于凝血化验的抗凝剂浓度应为（105～109）mmol/l（即3.13%～3.2%，通常被称为3.2%）的二水合物形式的柠檬酸钠[1]，用于血细胞沉降率检测的抗凝剂浓度应为（123～135）mmol/l（3.61%～3.96%,通常被称为3.8%）的二水合物形式的柠檬酸钠。本文分别通过渗透压法、高效液相色谱法、非水滴定法、原子分光光度法对柠檬酸钠溶液浓度进行测定，通过比较，确定了简单可行的检测方法。

1.仪器与材料

1.1 仪器

渗透压摩尔浓度测试仪（天津天河医疗仪器有限公司SMC-30C），高效液相色谱仪（美国Waters 公司），原子分光光度计（美国PE 公司AA800），超纯水机（默克密理博Milli-Q）。

1.2 材料

选用实验室检品为本次试验样品，柠檬酸钠二水合物（分析纯），乙二酸（分析纯），磷酸（色谱纯），甲醇（分析纯），超纯水（实验室自制），高氯酸（0.1mol/l 标准滴定溶液），冰乙酸（分析纯），乙酸酐（分析纯），结晶紫（分析纯），钠标准溶液（500mg/l,国家环境保护总局标准样品研究所，中华人民共和国国家标准GSB07-1262-2000，钠标准溶液证书101405）。

2.方法

2.1 渗透压法

2.1.1 标准曲线的制备

精密称取柠檬酸钠10g，置100ml 容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度约为100mg/ml 的溶液，再精密量取上述溶液适量，制成含柠檬酸钠为10-100mg/ml 的标准溶液。按照《中华人民共和国药典》2010 版附录ⅨG 渗透压摩尔浓度测定法，分别测定每点的渗透压。绘制标准曲线并求出回归方程。

2.1.2 样品溶液的制备

取采血管样品，分别测定每管的渗透压，将样品测定值代入回归方程并计算样品中柠檬酸钠溶液的浓度。

2.2 高效液相色谱法

2.2.1 测试条件

色谱柱：KC-811；流动相：0.5%磷酸溶液；流量：1.0ml/min；柱温：35℃；检测器：UV；进样量：10µl。

2.2.2 标准液的配制及标准曲线的绘制

2.2.2.1 标准贮备液制备

将柠檬酸钠在105℃条件下干燥3h 后，精确称取2.5g 于50ml 容量瓶中，溶解，稀释，摇匀，定容，即得到标准贮备液50mg/ml。

2.2.2.2 标准原液制备

精确移取2.2.2.1 项下标准贮备液5ml、12.5ml 分别置于25ml 的容量瓶中，用水稀释，摇匀，定容，即得到标准原液10mg/ml、25mg/ml。

2.2.2.3 内标液制备

精确称取0.5g 乙二酸到500ml 的容量瓶中，用水稀释，溶解、摇匀，定容即得。

2.2.2.4 标准液制备

分别精确移取10mg/ml、25mg/ml、50mg/ml标准原液2ml 到100ml 容量瓶中，再加入3ml 的乙二酸内标液，用水稀释，摇匀，定容，得到0.2mg/ml、0.5mg/ml、1.0mg/ml 的标准液。

2.2.2.5 标准曲线的绘制

用高效液相色谱仪对2.2.2.4 项的标准液进行测试，以浓度为纵坐标，峰面积为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程。

2.2.3 供试液的配制与测试

取采血管，第一次称重得W1（g），用约20ml 的水充分转移采血管内柠檬酸钠溶液至50ml 的容量瓶中，再加入3ml 乙二酸内标液后，用水稀释，摇匀，定容得供试液。用高效液相色谱仪测定供试液，通过标准曲线计算得到供试液浓度C（mg/ml）,吹干采血管内壁第二次称重得W2（g），样品中柠檬酸钠溶液的密度以1.0g/ml计算。

2.2.4 计算公式

CX=50×1.0×C/294.1×(W1-W2)

CX—样品中柠檬酸钠溶液的浓度，mol/l；

C—表示柠檬酸钠溶液的测试浓度，从标准曲线上读出，mg/ml；

（W1-W2）—表示采血管内柠檬酸钠溶液的重量，g

2.3 非水滴定法

2.3.1 样品前处理

取20 支采血管，分别用实验用水将样品内的柠檬酸钠溶液充分转移至100ml 的蒸发皿中，在水浴上蒸干。

2.3.2 测定方法

取上述蒸干后的柠檬酸钠固体粉末,用适量约10ml 冰乙酸加热充分溶解并转移到碘量瓶中,放冷，加乙酸酐10ml,再加 0.5%结晶紫溶液2 滴,用0.1N 的高氯酸标准溶液滴定至溶液显蓝绿色,同时做空白滴定试验 进行校正。

2.3.3 计算公式

C X=N(V-V 0)×0.0 9 8 0 3×1 0 0 0/294.1×20×V1

CX—柠檬酸钠溶液浓度，mol/l；

N—高氯酸标准当量浓度；

V—试样滴定消耗用高氯酸标准溶液体积,ml；

V0—空白滴定消耗用高氯酸标准溶液体积,ml；

V1—采血管中柠檬酸钠溶液的体积，ml；

0.09803 —1 毫克当量柠檬酸钠的质量，g。

2.4 原子分光光度法

2.4.1 标准溶液的制备

依据样品中钠的浓度以及钠元素的检测范围，选择以下浓度梯度进行稀释，20μg/ml，40μg/ml，60μg/ml，80μg/ml。

2.4.2 样品溶液的制备

取2 只采血管样品，分别用超纯水转移至50ml 容量瓶中，反复清洗，合并所有清洗液，加水稀释至刻度，摇匀，分别用0.45μm 的微孔滤膜进行过滤，即得二份供试品溶液。按照同样方法制备空白对照液。

2.4.3 试验方法

分别将钠标准溶液的不同浓度进样，得到不同的吸收率，以标准溶液的浓度为横坐标，吸收率为纵坐标，得到回归方程及相关系数，同样的方法将样品溶液分别进样，从曲线上可以读取样品的浓度，根据稀释倍数换算出柠檬酸钠溶液的浓度。

2.4.4 计算公式

X=C×50×0.001/23×V×3

X—样品中柠檬酸溶液的浓度,mol/l；

C—曲线上钠元素的浓度，μg/ml；

V—样品中柠檬酸钠溶液的体积，ml。

3.结果

3.1 渗透压法（表1）

表1.渗透压法

3.2 高效液相色谱法（表2）

表2.高效液相色谱法

3.3 非水滴定法（表3）

表3.非水滴定法

3.4 原子分光光度法（表4）

表4.原子分光光度法

4.试验讨论

从以上试验可以看出，每种方法都可以作为检测一次性使用真空采血管中柠檬酸钠溶液浓度的方法，但是每种方法又有着不同的优缺点。渗透压法检测柠檬酸钠溶液浓度，相关系数为0.9998，过程简单，使用的仪器为渗透压仪，价格便宜，可操作性强，为方便接受的一种方法；高效液相色谱法检测柠檬酸钠溶液浓度，虽然相关系数为0.9999，但是试验过程较复杂，使用的仪器为高效液相色谱仪，价格昂贵，试验的可接受程度不强，只能是有条件的单位方可采用的方法；非水滴法测定柠檬酸钠溶液的浓度，试验结果平行样结果良好，重现性也好，但是由于该过程试剂的配制比较繁琐，同时用到试剂乙酸酐，为有毒试剂，在市场上不容易买到，需要专一的领导和技术人员通过专一的培训后，取得资质后方可获得，给试验的进行带来了一定的难度，故该方法也受到一定的限制；原子分光光度法测定柠檬酸钠溶液的浓度，相关系数为0.9997，试验数据可信度较强，操作简单，但是同样用到的仪器为原子分光光度计，价格也是比较昂贵，该方法操作起来受到资金的限制，并不是每一个生产企业都可以达到的，所以也不是最为理想的方法。综上，渗透压法检测柠檬酸钠溶液浓度为一理想的、可操作性强的、可普及的可靠方法。