镉染毒对雄性大鼠骨生物力学性能的影响

秦波音，陈晓，朱国英，周晓辉，周文江，3

(1.上海市公共卫生临床中心，上海 201508;2.复旦大学放射医学研究所，上海 200032;3.复旦大学药学院动物中心，上海 201203)

骨骼是镉毒性靶器官之一［1］。人群调查及动物研究显示镉暴露可以导致骨密度下降及骨质疏松发生率的增高，并能增加骨折的发生率［2－4］。但是以往研究主要是侧重于镉对骨密度、骨矿含量等骨量的影响，而对于骨力学强度、骨微观结构等骨内在特性的研究很少，而这些也是影响骨功能的重要的因素［5］。鉴于此，本研究对镉暴露后大鼠股骨和腰椎生物力学性能改变做初步探讨，旨在为预防和评估镉骨损害提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验设计与分组

24 只8 周龄雄性Sprague－Dawley 大鼠【SCXK(沪)2008－0016】，饲养于上海市公共卫生临床中心动物中心SPF 级屏障系统【SYXK(沪)2010－0098】(12h 昼夜节律照明)，环境温度为22℃～25℃，湿度为40%～70%。大鼠予以标准饲料喂养，实验期间自由饮水和进食。适应7 d 后，随机分成4 组:对照组，背部皮下注射生理盐水(0.5mL);实验组，分别背部皮下注射0.1 mg Cd/(kg·bw)，0.5 mgCd /(kg·bw)，1.5 mg Cd/(kg·bw)，每周5 次，连续染毒12 周。大鼠经22%乌拉坦(0.5 mL/100g 体重)麻醉后，颈动脉取血约1mL，EDTA－2k 抗凝，－20℃保存用于血镉测定。收集大鼠腰椎(L1～L6)，用于骨密度测定;收集两侧股骨和第五腰椎分别用于组织镉含量测定及生物力学测试。

1.2 接触标志物测定

根据文献［6］，本研究采用电感耦合等离子体质谱仪(ICP－MS)测定血镉和骨组织镉含量，该方法的检测下限为0.4 ng/mL。0.5 mL 全血经过70%硝酸消化后，蒸干，然后加入适量H2O2后，再次蒸干，最后加入1 mL 硝酸溶解，经适当稀释后测定血镉浓度。去除股骨表面软组织后，将其经600℃高温灰化，加入1 mL 硝酸溶解，定容，适当稀释，测定骨镉含量。

1.3 骨密度测定

取L1～L6 腰椎，修整周围肌肉后，用生理盐水纱布包裹，应用双能X 线骨密度仪测定骨密度(Hologic QDR 4000)，仪器精度为1%，变异系数(CV)＜1%。

1.4 骨生物力学测定

取大鼠的右侧股骨，剔除周围软组织，置于生物力学仪(Instron 5566)上，跨距20 mm，速度2 mm/min，采用三点弯曲实验测定股骨生物力学性能，测定参数包括:弯曲载荷，应变，断裂能量;另取L5，剔除软组织，修平上下表面，去掉所有关节突，棘突，用上述生物力学仪，速度2 mm/min，采用压缩实验测定腰椎生物力学性能，包括:压缩强度，断裂能量，屈服强度和压缩载荷。

1.5 统计学方法

应用SPSS 11.5 统计分析软件，采用One－Way ANNOVA 分析，应用Pearson 相关对主要参数进行相关分析，数据以均数±标准差表示。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血镉

染毒组的血镉浓度显著高于对照组，差异具有统计学意义(P＜0.01)。此外，随着染毒剂量的增加，大鼠血镉水平也逐步增高，具有良好的剂量－效应关系(R=0.98，P＜0.01)。见图1。

图1 染镉剂量与血镉的关系Note:* P＜0.05，compared with the control group.Fig.1 Correlation of cadmium dose and blood cadmium in the rats.

2.2 股骨镉含量

股骨经高温灰化后，采用ICP－MS 测定大鼠股骨内镉负荷。结果显示，骨骼中有不同程度的镉蓄积。染毒组大鼠股骨镉负荷显著高于对照组，并且股骨镉水平与染毒剂量之间存在显著正相关(r =0.92，P＜0.01)。见图2。

2.3 镉对大鼠骨密度的影响

对骨密度的影响:随着染镉浓度及血镉的增高，大鼠的骨密度明显下降，呈现良好的剂量效应关系。中剂量组和高剂量组的大鼠骨密度明显低于对照组(P＜0.01)。三维作图更直观的表现出随着染镉和血镉浓度的增高，BMD 呈现下降趋势。见图3。

2.4 镉对大鼠骨生物力学的影响

高剂量镉暴露组大鼠股骨的生物力学指标(弯曲载荷、应变及断裂能量)明显低于对照组(P＜0.01)，见图4。染镉组大鼠腰椎的生物力学参数(断裂能量、压缩强度、屈服强度及载荷)都低于对照组，尤其是中剂量组和高剂量组，差异有统计学意义(P＜0.05)。此外，低剂量组腰椎压缩强度及断裂能量明显低于对照组(P＜0.05)。见图5。

图2 染毒剂量与股骨镉含量关系Note:* P＜0.05，compared with the control group.Fig.2 Correlation of cadmium dose and cadmium in the rat bone.

图3 大鼠骨密度与血镉、染毒剂量相关关系三维图Note:* P＜0.01，compared with the control group.Fig.3 3－dimensional relationship among BMD，cadmium dose and blood cadmium in the rats.

图4 镉对大鼠股骨生物力学性能的影响Note:* P＜0.01 vs 0，compared with the control group.Fig.4 Effects of cadmium on biomechanical properties of the femur in rats.

2.5 主要参数相关分析

对主要参数进行Pearson 相关分析发现，血镉与骨镉成明显正相关(P＜0.01);血镉及骨镉与大鼠腰椎及股骨骨生物力学指标成明显负相关(P＜0.01)。见表1。

3 讨论

骨质疏松症是一种以骨量减少、骨显微结构退化为特征，最终导致骨脆性增高、骨强度下降以及骨折危险增加的全身性骨骼疾病［7，8］，骨强度包含了骨骼的两个重要方面:骨矿物含量和骨质量［8］。由于人群研究中技术及伦理学等方面的限制，目前只能应用无创检查测定受访者骨密度，而对骨强度、骨显微结构等方面无法进行较系统的研究。动物实验也主要侧重于镉对骨量的影响，而对骨力学强度研究很少，而骨力学性能是评价骨质量不可缺少的指标［9］。

图5 镉对大鼠腰椎生物力学性能的影响Note:* P＜0.05 vs 0，compared with the control group.Fig.5 Effects of cadmium on biomechanical properties of the lumbar spine in the rats.

表1 主要参数相关分析Tab.1 Correlation analysis among the different variables

Brzoska 等［10，11］研究表明低剂量镉可以引起骨强度下降及骨折风险增加。本研究显示，镉染毒3个月后，大鼠腰椎及股骨的生物力学性能都较对照组有所下降。腰椎的生物力学性能在低剂量时已经有显著下降。提示在低剂量(0.1 mg Cd/kg)时，松质骨的力学性能首先受影响，随着剂量的增加，皮质骨的力学性能也受影响。值得注意的是，低剂量组在没有明显骨密度的下降的情况下，已经观察到腰椎力学性能的下降，这也提示单纯从骨量上来评价镉对骨的影响存在一定缺陷，骨力学性能要比骨量能更加敏感的反应镉对骨的影响。以往单纯选择骨密度及骨质疏松作为镉骨损害的效应指标可能在一定程度上不够完善。早期研究认为镉的骨损害继发于肾脏损害［12］。本研究中，高剂量组也同时存在肾脏及骨骼的损伤，这也支持以前认为骨损伤继发于肾脏损伤的结论。目前镉中毒卫生标准，主要是以肾脏损害作为依据之一。本研究提示从骨代谢、骨微结构、力学性能方面以及肾脏损害方面对镉中毒进行联合评价可能更有意义。

近年的流行病学研究证实不足以导致肾损害的低水平镉暴露(尿镉在0.5～2.0 μg/g 肌酐)也能增加女性的骨质疏松和骨折发生的风险［13－15］。体外研究及组织培养也表明较低水平镉可以干扰羟磷灰石形成，干扰成骨细胞活性和代谢，并能显著增加骨组织钙的释放［16］。胶原纤维是骨基质的主要成份之一，是影响骨力学强度的重要因素。研究表明镉可以减少骨胶原纤维的含量、干扰胶原纤维的铰链及排列［17，18］。我们的前期研究也表明低水平镉能抑制成骨细胞体外矿化水平［19］。低剂量镉对骨生物力学的影响可能与其干扰骨基质矿化有关。

本研究提示镉暴露能够影响骨生物力学性能;在镉的骨损害中，骨生物力学指标比骨密度要更为敏感。此外，镉对松质骨及皮质骨生物力学的影响存在差异，松质骨要比皮质骨更为敏感。

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