一支半固体盲样中食源性致病菌分离鉴定

张嵘 江晓 叶艳华 金萍 王炜

质控考核是提高实验室检验水平的重要途径，是对细菌实验室检测质量评价的方法。本实验室自2003年起每年参加国家认可委（CNAS）组织的检测能力验证计划，均取得了优异成绩，现将2012年国家认可委（CNAS）对本中心细菌实验室复评审进行质控考核结果分析如下。

1 材料与方法

1.1 待测样品 半固体盲样管。

1.2 仪器设备 ATB全自动鉴定及药敏测试仪，恒温培养箱，生化培养箱等。

1.3 培养基和试剂 ID32E鉴定条，科玛嘉各种显色培养基均购自法国梅里埃公司。氯化镁孔雀绿（MM），亚硒酸盐胱氨酸增菌液，缓冲蛋白胨水，7.5%氯化钠肉汤，LB增菌液，GN增菌液，1%葡萄糖肉汤，3%氯化钠碱性蛋白胨水，mLST-Vm增菌液，mEC肉汤， Bolton肉汤，CIN-I平板，skirrow琼脂平板，DFI琼脂平板，B.P平板，MYP平板，伊红美兰（EMB）平板，SS平板，HE平板，skirrow琼脂平板与mCCD平板，克氏双糖均购自北京陆桥公司，有效期内使用，血平板自行配置。

2 检测依据

GB/T4789.511，13，14-2003，GB/T4789.7，8，9，36-2008，GB4789.410，30，40-2010[1-3]。

3 检测与结果

3.1 增菌与分离 无菌操作，打开样品管，接种环蘸取半固体分别直接划线HE平板、SS平板、EMB平板、血平板、O157H7显色平板、科玛嘉沙门氏菌显色平板、科玛嘉副溶血性弧菌显色平板、skirrow琼脂平板、mCCD平板、P.K平板、CIN-I平板，DFI显色平板、科玛嘉李斯特氏菌显色平板MYP平板。除CIN-I平板26 ℃培养、skirrow琼脂平板与mCCD平板42 ℃微需氧培养、科玛嘉李斯特氏菌显色平板30 ℃培养，其余平板均置37 ℃需氧培养。同时半固体菌种管直接接种各选择性增菌液中37 ℃需氧培养（除LB1增菌液30 ℃培养24 h，TTB增菌液42 ℃ 24 h，PSB增菌液26 ℃培养48 h，Bolton肉汤微需氧42 ℃培养24～48 h，mLST 44 ℃24）后再接种相应的平板培养。

3.2 观察菌落形态（培养24 h） 经过培养后，平板上可见：EMB：圆形，光滑的紫红色菌落。HE：圆形，光滑边缘整齐的黄色菌落。CIN-I：圆形光滑凸起湿润红色菌落。SS：圆形光滑的湿润的粉红色菌落。科玛嘉沙门氏菌显色平板：蓝绿色圆形光滑的菌落。血平板：淡黄色圆形光滑小菌落。科玛嘉O157H7显色平板上：可见圆形光滑蓝绿色的菌落。

科玛嘉付溶血性弧菌平板：未见菌落生长。科玛嘉李氏菌显色平板：蓝绿色带晕圈可疑菌落。B.P平板：未见菌落生长。DFI平板：蓝绿色圆形光滑的可疑菌落。skirrow琼脂平板：灰白色菌落。mCCD平板：灰白色菌落。MYP平板：黄色圆形光滑菌落。

观察增菌液划线的平板：平板菌落形态同直接划线平板。

3.3 初步生化试验及染色镜检 将CIN-I上圆形湿润红色菌落挑选5个接种改良克氏双糖26 ℃培养，同时做尿素酶试验（结果为阴性）。科玛嘉沙门氏菌显色平板上蓝绿色菌落，O157H7显色平板上蓝绿色菌落，SS平板上粉红色菌落，HE平板上黄色菌落，DFI平板上蓝绿色的菌落，EMB上紫红色菌落各挑3～5个分别穿刺双糖斜面37 ℃培养观察均斜面和底层均变黄产气，同时挑取上述平板单菌落划线营养平板并做氧化酶试验及镜检。科玛嘉李氏菌显色平板上蓝绿色带晕圈可疑菌落镜检为革兰氏阳性小杆菌，上述其余平板上所有挑选的菌落氧化酶试验均为阴性，镜检均为革兰氏阴性小杆菌，

3.3.1 挑取科玛嘉李斯特氏菌显色平板上蓝绿色带晕圈可疑单菌落穿刺血平板做溶血试验（37 ℃培养24 h后刺种点周围可见狭小透明溶血环）及穿刺半固体做动力试验（30 ℃培养3 d后可见倒伞状生长）。

3.3.2 挑取DFI平板上蓝绿色的可疑单菌落接种TSA平板培养做进一步生化鉴定。DFI平板上转TSA平板上黄色菌落接种ATB ID32E条经鉴定为阪崎肠杆菌。科玛嘉李斯特氏菌显色平板上蓝绿色带晕圈可疑单菌落分纯于TSA平板上菌落经APILister鉴定为单增李斯特氏菌。综上，生化试验及镜检结果得出，该份半固体盲样中检出单增李斯特氏菌和阪崎肠杆菌。

4 讨论

近年来，由食源性致病菌引起的食物中毒的爆发流行不断发生，因其发病凶、传播快、危害大，已引起各国政府的高度重视，除了常见的引起食物中毒的食源性致病菌如沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌外，一些以往并不常检的食源性致病菌如单核细胞增生李斯特菌、阪崎肠杆菌及空肠弯曲菌等引起的食源性疾病屡有报道，因而增强对其的检测能力可对食物中毒原因的快速排查具有重要意义。

LM（单核细胞增生李斯特菌）是一种人畜共患的致病菌，由于它引起的感染病死率高，危害大，WHO将其列为20世纪90年代四大食源性致病菌之一，由其引起的食物中毒性疾病在欧美国家常有发生，轻者为一般胃肠炎症状，重者主要表现为败血症，脑膜炎等甚至死亡[4-6]。虽然我国目前对食品中单核细胞增生李斯特菌检出未做具体要求，但美国要求其在食品中不得检出，欧洲各国要求单核细胞增生李斯特菌在每克食品中小于100 cfu，通过近几年食品污染物调查结果显示，单核细胞增生李斯特菌在生肉及即食食品中污染率较高，警示大家防止单核细胞增生李斯特菌引起的食物中毒事件发生。

阪崎肠杆菌是乳制品中近几年新发现的一种致病菌。它是存在自然环境中的一种“条件致病菌”，已被世界卫生组织和许多国家确定为引起婴幼儿死亡的重要条件致病菌，可导致任何年龄层人群的疾病，尤其是对早产儿、出生体重轻的婴儿或免疫受损婴儿的威胁最大，严重者可导致败血症、脑膜炎或坏死性小肠结肠炎[7]。继美国FDA2002年在本土某一些国际乳业巨头生产的婴儿配方奶粉中检出阪崎肠杆菌后，2003年又一家国际乳业巨头公司主动召回在美国生产的一批检出极微量阪崎肠杆菌的罐装早产儿特殊配方奶粉，此后成为世界关注的焦点。我国在2005年5月通过《奶粉中阪崎肠杆菌检测方法》行业标准的审定，对奶粉严查此菌。

总之，参加国家认可委（CNAS）组织的检测能力验证，提高了实验室检验人员对突发传染病、细菌性食物中毒的病原诊断及应急能力，促进国家认可实验室水平的不断提高。

[1]卫生部.GB/T4789-2003 食品卫生微生物学检验[S].北京：中国标准出版社，2003.

[2]卫生部.GB/T4789.9-2008 食品卫生微生物学检验[S].北京：中国标准出版社，2008.

[3]卫生部.GB4789.4-2010 食品安全国家标准 食品微生物学检验[S].北京：中国标准出版社，2010.

[4]Gasanov Hughes U D，Hansbro P M.Methods for the isolation and identification of Listeria spp and Listeria monocytogenes： a review[J].FEMS Microbial Rev，2005，29（5）：851-875.

[5]周晓辉，焦新安.产单核细胞李斯特菌的分子鉴定与亚分型研究[J].中国人畜共患病杂志，2003，19（5）：44-47.

[6]周晓辉，焦新安，邓云飞，等.应用PCR快速检测单核细胞增生李斯特菌的研究[J].扬州大学学报表，2002，23（3）：1-4.

[7]卢雁，王淼，房玉国，等.婴儿配方粉中阪崎肠杆菌荧光定量PCR检测方法的建立[J].中国乳品工业，2008，36（7）：47-49.