强直性脊柱炎与HLA-B27基因亚型动态定量表达的相关性研究*

黄建民 李荣需 周玲 陈冬萍 刘永青 林周胜

强直性脊柱炎（Ankylosing Spondylitis AS）是一种类风湿因子阴性，主要累及中轴关节和肌腱韧带附着点的慢性进行性炎症疾病，可引起腰痛、晨僵、脊柱活动受限、驼背畸形、外周关节受累、肌腱端炎、足跟痛等关节症状以及眼部前葡萄膜炎、心血管表现、肺部表现、骨质疏松等关节外症状，AS致残率高，早期确诊对AS患者非常重要。AS与HLAB27（Human Leucocyte Antigen B27，人类白细胞抗原B27）关系密切已被公认，90%以上的AS患者HLA-B27呈阳性。人们发现HLA-B27在基因水平上存在较大异质性，存在多个等位基因，不同亚型有着不同的地域和人种分布特点。另外HLA-B27同一亚型在不同人群中与AS的关联也可不同。本研究将对东莞地区HLA-B27阳性患者及健康人的HLAB27基因亚型进行检测，揭示本地区主要致病亚型及可能的保护亚型，并从HLA-B27基因亚型的动态表达量揭示与AS的相关性，为本地区AS的防治提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2010年3月-2012年12月本院骨科门诊HLA-B27阳性的AS确诊患者100例（符合1983年修订的纽约标准），男81例，女19例， 年龄13～70岁，平均（29±8.37）岁；HLA-B27阳性健康对照组30例，男24例，女6例，年龄14～65岁，平均（30±6.45）岁。两组年龄、性别等一般资料比较差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 试验仪器与试剂 BDcanto2流式细胞仪由美国BD公司生产，HLA-B27荧光抗体F1（FITC）、CD3荧光抗体F2（PE）、校准微球和溶血素均来自BD公司。PCR仪器购自上海宏石SLAN，高速离心机购自ACI公司，型号PK121R。电泳仪购自Bio-Rad公司，型号PvowerPAC200，全血DNA提取试剂盒、PCR试剂盒购自宝生物大连有限公司，DNA测序仪由美国ABI公司生产，型号3130。

1.2.2 应用流式细胞术定性检测外周血T淋巴细胞HLAB27 定性检测：抽取HLA-B27阳性AS患者及HLA-B27阳性健康对照组外周静脉血100 uL，EDTA抗凝，采用BD公司HLA-B27试剂盒，按照说明书步骤进行，在BDcanto2流式细胞仪上检测，结果判断为阴性/阳性。

1.2.3 HLA-B27基因亚型测定 采用PCR-SSP（序列引物扩增法）技术检测HLA-B27阳性AS患者及HLA-B27阳性健康对照组HLA-B27亚型的DNA。酚氯法提取外周血液细胞DNA，按照WHO2009年公布的44个HLA-B27等位基因，选择相关亚型的引物试剂盒，进行DNA扩增，凝胶电泳分离并用荧光染色来检测PCR反应的最终产物。

1.2.4 HLA-B27亚型的mRNA定量 荧光实时定量RTPCR技术检测HLA-B27阳性AS患者及HLA-B27阳性健康对照组HLA-B27亚型的mRNA，Trizol法提取外周血液细胞RNA，逆转录为cDNA，荧光实时定量扩增，观察和记录结果。

1.3 统计学处理 采用SPSS 10.0统计软件，计量资料用（±s）表示，两组HLA-B27mRNA 表达水平比较采用t检验，对HLA-B27mRNA 表达水平与强直性脊柱炎患者疾病活动指数进行Pearson相关统计分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 100例HLA-B27阳性AS患者检出HLA-B2704亚型55例，HLA-B2705亚型45例，30例HLA-B27阳性健康对照组检出HLA-B2704亚型13例，HLA-B2705亚型12例，HLA-B2706亚型3例，HLA-B2709亚型2例。

2.2 100例HLA-B27阳性患者HLA-B27mRNA 表达水平最低值为1.16，最高值为37.01，均值（7.77±6.19），30例HLA-B27阳性健康对照组表达水平最低1.05，最高值2.10，均值（1.51±0.27），两组比较差异有统计学意义（P=0.002）；HLA-B27阳性患者HLA-B27mRNA 表达水平与强直性脊柱炎患者疾病活动指数密切相关（R=0.707）。

3 讨论

AS是一种主要累及中轴关节的慢性进行性炎症疾病，临床表现为腰、骶以及下肢关节疼痛，晚期患者脊柱僵硬、活动受限。我国AS发病率约为0.3%，多见于中青年男性。AS致残率高，早期确诊对强直性脊柱炎患者非常重要。目前的AS确诊方法主要是依靠临床表现和影像学、实验室检查结果。AS与HLA-B27关系密切已被公认，90%以上的AS患者HLA-B27呈阳性。1973年Brewerton和Schlosstein[1-2]首次报道HLA-B27与AS相关以来，AS是迄今已知的HLA-B27与疾病关联最强、最典型的疾病。因此临床研究中找出本地区HLA-B27基因亚型及基因亚型表达量与AS的病情关系，为本地区AS的诊治提供理论和临床依据具有重要意义。

研究显示，HLA-B27亚型在不同的种族和地区中分布情况不同。2009年WHO正式命名的HLA-B27等位基因已达44个，不同亚型有着不同的地域和人种分布特点[3]，如B2705亚型几乎见于所有人种，但B2703亚型主要见于西非人群，而B2704亚型则是中国汉族人的优势亚型。另外HLA-B27同一亚型在不同人群中与AS的关联也可不同。有报道认为，2705、2704、2702亚型与AS的发生呈正相关，而2703、2708、2709、2707与AS的发生呈负相关[4-6]，而2706亚型则被普遍认为是AS的保护性基因。本研究显示：本地区HLA-B27阳性患者仅发现2704与2705亚型，且2704亚型占55%，2705亚型占45%，HLA-B27阳性健康者发现4种亚型，2704亚型占43.33%，2705亚型占40%，2706亚型占10%，2709亚型占6.7%。揭示本地区主要亚型分布为2704亚型与2705亚型，且2704亚型为优势亚型，而2706亚型及2709亚型仅见于HLA-B27阳性健康者，提示2706亚型及2709亚型为本地区保护亚型。

HLA-B27在AS发生中的病理作用目前尚不十分清楚。作为一种重要的免疫分子，HLA-B27主要功能是与抗原结合并将其提呈给T淋巴细胞，这一功能在AS和正常人中都有表现。HLA-B27重链可以形成同源二聚体，大多数AS患者T淋巴细胞都能表达这种二聚体的配体，这说明HLAB27重链二聚体可能参与了AS的病理发生过程，而HLAB27可能在免疫过程中具有重要作用[7-8]。因为通过检测HLA-B27基因亚型无法有效区分AS患者及HLA-B27阳性健康人，采用定量PCR检测HLA-B27mRNA表达有可能解决这一问题。本研究对HLA-B27阳性AS患者及HLAB27阳性健康对照组均进行了RT-PCR技术检测，发现两组HLA-B27mRNA表达量差异有统计学意义（P=0.002），HLA-B27阳性AS患者呈现高表达，而HLA-B27阳性健康对照组呈现低表达。这也说明了本地区虽然HLA-B27基因亚型无论是AS患者或是健康人均是2704及2705，基因亚型高表达者患病，低表达者未患病。同时提示基因型低表达的HLA-B27阳性健康者随着基因亚型表达量增加可能成为AS患者，因此临床工作中对HLA-B27阳性健康人进行RTPCR技术检测HLA-B27mRNA表达量，作为一种辅助诊断的有效手段，可以更早期发现AS患者，使AS的防治真正达到早发现、早诊断、早治疗，将AS的致残率降到最低。

AS患者关于其疾病活动性评价，目前临床大多数专家认可的、应用最为广泛的是毕氏强直性性脊椎炎疾病活动指数（BASDAI），它与腰椎MRI急性炎症评分有很好的一致性[9]，虽然新的直性脊柱炎病情活动度评分（ASDAS）在判断AS患者病情活动度时的敏感性稍高[10]，但毕氏法仅需患者对自身病情的主观评价，无需MRI及过多的抽血化验等高成本检查，在中国仍最常用，能够反映患者的病变活动性。本研究发现HLA-B27阳性患者HLA-B27mRNA 表达水平与AS患者毕氏疾病活动指数密切相关（R=0.707），这也为进一步从分子水平治疗AS提供了有力证据，未来可能通过转录水平的调控，降低AS患者的HLA-B27mRNA表达量来减轻AS患者的病情。但HLA-B27是人类基因中的一个等位基因，具有高度的多态性，不同地区及种族中存在明显差异，仍需进一步从转录、翻译调控等分子水平作更多的研究[11]。总之，本研究揭示本地区HLA-B27基因主要致病亚型和可能的保护亚型，并从分子转录水平揭示了HLA-B27基因动态表达量与强直性脊柱炎患者疾病活动指数相关性，为临床及早防治AS提供了新的理论依据，具有重要临床意义。

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