结直肠癌的DNA甲基化研究进展

李晓阳 颜才华 马一杰 陈小兵 罗素霞

郑州大学附属肿瘤医院 河南省肿瘤医院内科，河南郑州 450008

结直肠癌是全世界癌症死亡的主要原因之一，它的发生由一系列遗传学及表观遗传学方面的改变使正常的上皮组织发展为浸润性癌的过程。这个过程首次在Fearon和Vogelstein设计的典型的腺瘤癌症发展模型中被提出[1]。该模型的提出，使我们对结直肠癌分子发病机制的认识大幅提高，目前认为结直肠癌的发生涉及多种分子通路，包括基因突变和表观遗传学改变[2]。过去十年，关于肿瘤表观遗传学的研究已取得了重大的进步，特别是DNA异常甲基化方面。对结直肠癌表观遗传学进行研究，可进一步揭示结直肠癌的发病机制，为结直肠癌临床诊断、治疗和预后评价提供重要生物学标志。

1 表观遗传学简介

表观遗传学是指不涉及DNA序列改变的情况下，基因的表达与功能发生改变并产生可遗传的表型。基因表达的表观遗传学调控发生于正常的组织，在胚胎发育、基因印记和组织分化中发挥重要作用[3]。异常的表观遗传学改变最早于1982年在结直肠癌中发现，从此开启了对表观遗传学研究的热潮，包括调控正常组织和癌组织中基因表达的一系列复杂的表观遗传调节机制[4]。表观遗传学修饰很大程度上影响着核染色质凝固状态，决定了DNA能否正常表达蛋白质，调控着基因转录。“开放”的染色质状态可进行基因转录，相反，浓缩或者“关闭”的染色质状态阻止基因转录[3]。目前在肿瘤形成中发挥重要作用的表观遗传学机制有以下几方面：①CpG岛区域胞嘧啶的DNA甲基化；②组蛋白转录后修饰；③siRNA和miRNA；④核小体定位[3]。在这篇综述里将重点介绍DNA甲基化，因为它在结直肠癌表观遗传学调控机制中研究的最为广泛。

2 DNA甲基化及其在大肠癌发病机制中的作用

2.1 DNA甲基化

DNA甲基化是由DNA甲基转移酶（DNMT）催化S腺苷甲硫氨酸作为甲基供体，将胞嘧啶转化为5-甲基胞嘧啶的反应[5]。通常，最易被DNMT作用的是CG二核苷酸序列，即CpG。正常哺乳动物细胞的大多数CpG序列存在甲基化，非甲基化CpG序列仅存在DNA的CpG岛区域。CpG岛通常被定义为GC含量大于50%，长度大于200～500个碱基的一段序列，并且观测到的CpG比例较预测的比例高0.6[6]。60%～70%的基因启动子区域含有CpG岛，并且处于非甲基化状态，在肿瘤中，他们发生异常甲基化。启动子区域CpG岛的甲基化与转录沉默有关，发生在基因启动子区域以外CpG位点的甲基化称为基因体甲基化，与转录失活无关，而与转录活化相关[7]。

基因的甲基化模式对基因表达的调控至关重要。CpG甲基化可以通过多种机制导致转录失活，如直接抑制顺式作用原件AP-2、CREB、E2F等[8]。DNA甲基化的一个重要机制是通过与调节核染色质结构的酶合作交互调控基因表达。这种合作交互机制与一种甲基结合蛋白（PcG）有关，通过与高亲和力的甲基化DNA结合导致级联放大反应，招募蛋白质改变染色质结构来调控组蛋白乙酰化、组蛋白甲基化及染色质重塑，从而使染色质固缩并封闭转录因子到启动子区域的通道[9]。DNA甲基化、组蛋白修饰和染色质重塑之间的相互作用错综复杂，存在各种各样的串话。异常的DNA甲基化有可能改变染色质重塑和基因表达，组蛋白及其修饰蛋白的调节异常可能导致异常的DNA甲基化。研究表明PcG蛋白复合体PRC2的异常活化可能是诱导肿瘤中DNA异常甲基化的机制之一[10]。

2.2 DNA甲基化与年龄因素

年龄是结直肠癌发生的一个重要危险因素，老化的肠黏膜表现为年龄相关的整个基因组的低甲基化和某些特定区域的高甲基化。起初认为组织结构正常的肠上皮细胞上的ESR1、IGF2和TUSC3基因的异常甲基化与年龄相关，随后发现另外一些基因也存在年龄相关性甲基化[11]。约50%年龄相关性甲基化基因与结直肠癌发病机制相关的基因是相同的，这表明年龄相关性基因在增加肿瘤易感性上起到一定的作用。有研究表明年龄相关性DNA甲基化和肿瘤相关性DNA甲基化机制可能是相同的，然而年龄相关性异常甲基化的机制仍不清楚[12]。在老年人正常组织中检测到异常DNA甲基化提示高龄肠癌患者比低龄者存在更多的表观遗传学驱动事件[13]。

2.3 DNA甲基化与结直肠癌的发生、发展

目前认为在多数结直肠癌基因组中存在成百上千个异常甲基化基因，且只有一部分可能与这些肿瘤的发生有重要关系。在正常黏膜向腺瘤，息肉向肿瘤的进展过程中，可以显而易见地看到发生甲基化的基因大幅增加，比较正常黏膜和早期腺瘤，早期腺瘤和进展期腺瘤，甲基化基因在不段大幅增加[14]。Esteller[15]研究发现结直肠腺瘤中MGMT、MLH1等DNA修复基因的异常甲基化可能促进腺瘤发生恶变。

Toyota等[16]于1999年提出了这些肿瘤中有一个独特的分子发病机制，称为CpG岛甲基化表现型（CIMP），且接近20%的结直肠癌是CIMP肿瘤。CIMP可在进展期管状腺瘤中检测到，但是在管状腺瘤早期却不是普遍能检测到的[15]。目前尚不清楚在息肉形成结直肠癌的晚期能否检测到CIMP。另外，CIMP肿瘤中存在高突变率的BRAF基因，并且常发生在女性的右半结肠[17-18]。有研究对125例结直肠癌标本进行了全基因组DNA甲基化性能分析，将CIMP肿瘤分为CIMP-H和CIMP-L，前者表现为异常高频的肿瘤特异性DNA甲基化，与MLH1甲基化和BRAF突变密切相关[19]。目前CIMP肿瘤发生的潜在原因还不清楚，但已表明与吸烟有关，同时有证据表明与营养状态、体型、身体活动情况等也有一定关联[20]。然而，总体来看，DNA的异常甲基化主要涉及结直肠癌形成的早期事件，较少涉及进展期事件。

3 DNA甲基化在结直肠癌临床应用中的价值

3.1 DNA甲基化与结直肠癌的早期诊断

对于将甲基化基因作为结直肠癌特异性生物学标志物，目前最先进的用途是基于DNA水平的结直肠癌的筛查。虽然目前肠镜仍是结直肠癌筛查最准确的方法，但是由于该检查操作程序较复杂及存在一定的并发症，患者依从性欠佳。尽管大便潜血检查价格便宜且操作简单，但灵敏性和特异性相对较低。笔者对结直肠癌分子病理学方面的研究进展，已将这些有应用前景的早期检测分子标记用于结直肠癌的非侵袭性筛查。启动子区域的一些基因在早期结直肠癌中存在高甲基化，可作为早期检测标志物。粪便中的甲基化波形蛋白是已得到验证的结直肠癌早期检测标记，人波形蛋白基因（VIM）在53%～84%的结直肠癌患者中存在异常甲基化，有报道提出灵敏度达到83%，特异性达到82%[21]。另外，在欧洲和中东已将检测外周血中甲基化SEPT9基因的检测用于结直肠癌筛查，目前正不断地在提高用粪便、血浆进行甲基化分析达到临床用途的可行性[21]。

3.2 DNA甲基化与结直肠癌疗效及预后评价

由于CpG岛高甲基化和整体DNA的低甲基化之间的相反关系，对关于结直肠癌临床应用的表观遗传学标志的研究主要集中在基因的甲基化，本课题组研究发现TIP30启动子在高转移性、低分化的大肠癌细胞株HCT116和非高转移性的大肠癌细胞株HT29中存在CpG岛高甲基化，这可能是抑癌基因TIP30表达降低或缺失的机制之一[22]，与笔者前期关于大肠癌组织中TIP30蛋白表达情况[23]及TIP30过表达能抑制大肠癌细胞生长，降低其侵袭、迁移能力[24]等研究结果相一致。另外，还发现结直肠癌TIP30启动子甲基化状态与患者淋巴结转移、临床分期及对5-FU、奥沙利铂化疗药物的敏感性相关[22,25]。

Ide等[26]研究发现，肿瘤CIMP状态可作为5-FU反应性的预测标记，然而目前关于CIMP状态与5-FU辅助治疗反应性之间的尚存在相互矛盾的数据。低甲基化的LINE-1作为一种生物学标志已在研究，近来Ahn等[27]研究表明，甲基化的LINE-1有望成为近端结直肠癌无病生存期较短的预后指标，且肿瘤复发患者LINE-1的甲基化水平较无复发者低。然而，迄今为止的数据还不足以支持将基因甲基化作为预测性生物指标。

4 结论

在过去十年里，表观遗传学对肿瘤发病机制作用的研究取得了飞速发展，现已明确表观遗传学事件是结直肠癌发病机制的驱动事件，表观遗传学事件与基因突变共同参与正常肠黏膜向结直肠癌进展的过程，而且结直肠癌基因组中受异常DNA甲基化影响的基因较受基因突变影响的基因多。异常DNA甲基化的研究为结直肠癌的早期诊断、预后判断和干预治疗提供了新的思路，并且已经展现了良好的前景。

[1]FearonER，VogelsteinB.Ageneticmodelforcolorectaltumorigenesis[J].Cell，1990，61：759-767.

[2]Fearon ER.Molecular genetics of colorectal cancer [J].Annu Rev Pathol，2011，6：479-507.

[3]Sharma S，Kelly TK，Jones PA.Epigenetics in cancer[J].Carcinogenesis，2010，31：27-36.

[4]Suzuki MM，Bird A.DNA methylation landscapes：provocative insights from epigenomics[J].Nat Rev Genet，2008，9：465-476.

[5]Bestor TH.The DNA methyltransferases of mammals [J].Hum Mol Genet，2000，9：2395-2402.

[6]Gardiner-Garden M，Frommer M.CpG islands in vertebrate genomes[J].J Mol Biol，1987，196：261-282.

[7]Hellman A，Chess A.Gene body-specific methylation on the active X chromosome[J].Science，2007，315：1141-1143.

[8]Comb M，Goodman HM.CpG methylation inhibits proenkephalin gene expression and binding of the transcription factor AP-2 [J].Nucleic Acids Res，1990，18：3975-3982.

[9]Hinoue T，Weisenberger DJ，Lange CP，et al.Genome-scale analysis of aberrant DNA methylation in colorectal cancer[J].Genome Res，2012，22（2）：271-282.

[10]McCabe MT，Lee EK，Vertino PM.A multifactorial signature of DNA sequence and polycomb binding predicts aberrant CpG island methylation[J].Cancer Res，2009，69：282-291.

[11]Toyota M，Issa JP.CpG island methylator phenotypes in aging and cancer[J].Semin Cancer Biol，1999，9：349-357.

[12]Fraga MF，Esteller M.Epigenetics and aging：the targets and the marks[J].Trends Genet，2007，23：413-418.

[13]Alemayehu A，Sebova K，Fridrichova I.Redundant DNA methylation in colorectal cancers of Lynch-syndrome patients[J].Genes Chromosomes Cancer，2008，47：906-914.

[14]Kim YH，Petko Z，Dzieciatkowski S，et al.CpG island methylation of genes accumulates during the adenoma progression step of the multistep pathogenesis of colorectal cancer [J].Genes Chromosomes Cancer，2006，45（8）：781-789.

[15]Esteller M.Inactivation of the DNA-repair gene MGMT and the clinical response of gliomas to alkylating agents[J].N Engl J Med，2000，343：1350-1354.

[16]Toyota M，Ahuja N，Ohe-Toyota M，et al.CpG island methylator phenotype in colorectal cancer [J].Proc Natl Acad Sci USA，1999，96：8681-8686.

[17]Weisenberger DJ，Trinh BN，Campan M，et al.DNA methylation analysis by digital bisulfite genomic sequencing and digital methylight[J].Nucleic Acids Res，2008，36：4689-4698.

[18]Curtin K，Slattery ML，Samowitz WS.CpG island methylation in colorectal cancer：past，present and future [J].Patholog Res Int，2011，2011：902674.

[19]Yagi K，Akagi K，Hayashi H，et al.Three DNA methylation epigenotypes in human colorectal cancer [J].Clin Cancer Res，2010，16：21-33.

[20]Limsui D，Vierkant RA，Tillmans LS，et al.Cigarette smoking and colorectal cancer risk by molecularly defined subtypes [J].J Natl Cancer Inst，2010，102：1012-1022.

[21]Li M，Chen WD，Papadopoulos N，et al.Sensitive digital quantification of DNA methylation in clinical samples [J].Nat Biotechnol，2009，27：858-863.

[22]陈小兵，吕慧芳，曹新广，等.TIP30基因启动子甲基化与大肠癌细胞5-氟尿嘧啶化疗敏感性的关系[J].胃肠病学和肝病学杂志，2012，21（2）：133-136.

[23]Chen X，Cao X，Dong W，et al.Expression of TIP30 tumor suppressor gene is down-regulated in human colorectal carcinoma [J].Dig Dis Sci，2010，55（8）：2219-2226.

[24]吕慧芳，刘红亮，陈小兵.TIP30基因对大肠癌细胞HCT116生物学特性的影响[J].肿瘤防治研究，2012，39（1）：13-17.

[25]陈小兵，马一杰，陈贝贝，等.TIP30基因启动子甲基化与大肠癌细胞奥沙利铂化疗敏感性关系的研究[J].中国医药科学，2012，24（4）：14-16.

[26]Ide T，Kitajima Y，Ohtaka K，et al.Expression of the hMLH1 gene is a possible predictor for the clinical response to 5-fluorouracil after a surgical resection in colorectal cancer [J].Oncol Rep，2008，19：1571-1576.

[27]Ahn JB，Chung WB，Maeda O，et al.DNA methylation predicts recurrence from resected stageⅢproximal colon cancer[J].Cancer，2011，117：1847-1854.