基因芯片在中医学领域应用的研究进展

高冬梅

（山东中医药大学中药学博士后流动站，济南250355）

当新世纪曙光升起的时候，人类基因组测序工作已接近尾声，进一步了解基因产物及其相互关系及实现从基因结构到基因功能跨越的后基因组研究，已成为生命学科的热切要求。应运而生的基因芯片技术给后基因组研究提供了有力的技术支持。与此同时，中医界的一些有识之士也纷纷撰文憧憬着基因芯片技术在中医药研究的应用［1］。中药品种繁多，如何筛选出有效中药，进而从有效中药中筛选出有效成分，并快速进行中药毒理学研究，如何高效、快捷地应用于临床，是中药药理研究的重大问题。传统的方法学对逐个单味药进行分析，进而对其不同有效成分（单体）进行实验，其过程复杂，耗时多，投入量大，但产出却很少。相反，如果采取高通量基因芯片筛选方法，快速筛选出有效成分，并快速完成毒理学实验，并利用计算机系统综合分析各种成分间相互作用关系，绘制出中药复杂成分间相互作用的可能图谱，有望大大加快中药现代化进程，也为中药产业化提供技术保障。

基因芯片又称DNA微阵列技术，简称DNA芯片。最早是由E.Southern在1989年提出，是在芯片上按照特定的排列方式，固定上大量探针，形成一种DNA微矩阵，将样品DNA／RNA扩增、体外转录等技术掺入标记分子后，与位于芯片的探针杂交通过同位素法、化学荧光法、化学发光法或酶标法显示，利用计算机进行综合分析，获得样品中大量基因序列及表达的信息。该技术具有高通量和平行检测的优势。现就近10年基因芯片在中药领域的应用与意义阐述如下。

1 基因芯片在中药领域的应用

1.1 在基因水平上寻找药物靶标，解释药物作用机制将中药视为组合化学库，筛选其中的有效成分，由此比较基因芯片上基因表达谱的变化，则有可能开发作用机制较明确的新中药。采用所谓 “译码器”策略 （decoder strategy）来确定药物靶标，从而找到 “导向药物”或“特效药”。当然，从中药及其复方中筛选离子通道特异性调节剂、蛋白激酶抑制物或激活剂、细菌或肿瘤组织的耐药性抑制剂等，都可采用基因或蛋白质芯片技术，将中药及其复方直接作用于基因组或蛋白组，观察特定基因表达或蛋白质构象或活性。传统的膜片钳或受体药理方法发现，川芎嗪、粉防己甲素具有钙通道拮抗剂作用，这种研究是复杂的。如果采用基因芯片，从人类基因库中提取所有离子通道基因，采用芯片技术，在不同基因及其表达的蛋白上加上中药，观察中药对基因表达或蛋白构象变化的影响，从而迅速了解此药物的可能作用机制［2］。托娅等［3］利用基因芯片技术，从基因水平解释抗肿瘤血管生成中草药的有效组分T3d的分子机制，采用人胃癌BGC823细胞和血管内皮细胞 （EC），结果BGC823细胞组有2.53%基因表达谱发生明显的变化，其中158条基因在经过T3刺激后表达量明显上升，44条明显下降。EC组有0.456%的基因表达谱发生明显的变化，其中30条基因在经过T3刺激后表达量明显上升，7条明显下降。因此利用基因芯片技术可以从基因水平解释中药的作用机制［4－8］，为新药的开发提供依据。

在新药开发中，高通量的DNA芯片可发现众多的新基因和新的靶分子用于新药的设计。噬菌体展示技术可创造大量蛋白质，目前多用于抗体库的建立和筛选，进而可用于受体－配体相互作用的研究。基因组学、蛋白质组学和生物信息学 （bioinformatics）将大大促进制药工业的发展。目前第一个生物分子工程药物Herceptin已用于乳癌的治疗，并获得美国FDA的批准。除肿瘤外，用分子生物工程设计的药物可用于治疗遗传病及代谢疾病，延缓衰老，也可用分子生物工程技术设计新的抗生素和工业用酶等。同时，一种药物的作用是多方面的，基因芯片有助于发现一种药物的新功能。原先设想的作用是针对某一靶标的，但在全基因或广范围筛选中却发现该药在另一方面有很强的抑制作用，从而为开发成另一种新药开辟新途径。

1.2 鉴定药物的潜在效应 基因芯片在用来研究药物的作用机制时十分有用。Matron［9］等人利用基因芯片构建了免疫抑制性药物FK506处理酵母细胞后的基因表达图谱。发现用FK506处理的酵母细胞基因表达图谱与FK506靶标的无意义突变体相似；而用FK506去处理此突变体，发现了不同于野生型的作用机制。Clarke等［10］应用基因芯片研究了肠癌患者化疗前和治疗期间肿瘤基因表达情况，发现丝裂霉素C和5－氟尿嘧啶治疗均可使糖苷合成酶和尿嘧啶－DNA糖基酶的基因表达增加。该研究提示，这类研究既有助于阐明药物的作用机制，也有助于确定药物作用的靶基因，为新药研究提供线索。通过这种方法能有效地筛选出有效中药及其有效成分。

1.3 用于芯片毒理学研究 应用芯片查找药物的毒性或不良反应，进行毒理学研究。尤其是慢性毒性和不良反应，普通的药理学方法耗时长，需要的人力和物力多，而且还有可能遗漏某些可能存在的潜在毒性和不良反应。而在基因水平进行分析，观察中药对人体一些看家基因（house－keeping gene）成分是否具有影响，如细胞骨架基因、组蛋白基因等，便能彻底了解该中药的可能毒性和不良反应。如果该药能抑制重要基因的表达，则对它的深入研究就值得考虑。如果中药中某种成分具有这种作用，那么对它进行改造时，就应该去除该成分，以便取长补短。目前国内尚未正式进行基因芯片的药理学研究，但中药药理学研究可以借鉴西药药理研究方法，从而给中药药理研究带来启示。

在国外，利用芯片进行药理学实验已相当普及。Nuwaysir等［11］研制了包括涉及细胞凋亡、DNA复制和修复、氧化应激或氧化还原内稳态、过氧化物酶体增殖反应、二恶英或多环芳烃反应、雌激素反应、看家基因、癌基因和抑癌基因、细胞周期控制、转录因子、激酶、磷酸酶、热休克蛋白、受体、细胞色素P450等共2090个基因的毒理芯片 （Tox Chip v1.0），该芯片既可用于毒物的检测和遗传多态性的检测，又可用于受检毒物的毒性作用机制研究。2000年，牛津大学的Pennie等［12］构建了ToxBlot芯片，并对基因芯片技术应用于毒性机制和毒性预测进行了研究。ToxBlot芯片能够完成有关内分泌的破坏、肝细胞毒性和胰岛素敏感化合物骨髓毒性的研究。最近，Holden等从人和小鼠文库中选择约600个与毒理学相关基因的cDNA克隆，制备了种属特异的病理基因组学芯片，可研究肝脏毒性、内分泌干扰、致癌作用等毒性终点的作用机制，也可用于确定以基因表达模式为基础的化合物的毒性。此技术应用于毒理研究目前国内尚未见报道，但可以预见，如中药药理学研究引入基因芯片技术，将大大推动中药研究的国际化进程，对阐明中药作用机制，具有无可估量的重要意义。

1.4 有效中药和中药有效成分的大规模筛选 中药的有效成分十分复杂，传统的药理研究方法周期长，耗时多，所需财力大，而采用基因芯片研究，将数千种不同中药或中药不同成分作用于一定的培养细胞后，甚至是人体的克隆细胞，观察它们对基因表达的影响，从而能从基因组水平了解它们的作用机制与作用范围，大大加快有效中药和中药有效成分的大规模筛选过程。另外，对新发现的中草药的功能鉴定也起到一定的作用。目前，这种用于药材鉴别的基因芯片仍处在研究阶段，已有人对贝母进行特异性序列和鉴别芯片的实验研究，相信不久的将来基因芯片就会广泛应用于中医药领域［13］。

1.5 中药复方研究 中药复方成分复杂，传统方法是将其中的中药进行不同组合，进行 “拆方”、“组方”，从而推出复方的可能作用机理，而且其作用仅限于研究的某一方面或几方面作用，很难对该复方有全面的认识，尤其是对新功能的认识和开发。而采用基因芯片技术，能迅速了解该复方对基因组中某些基因表达的影响，从而不仅了解该复方的原有功能，还有可能很轻易地发现该复方组方后可能出现的新功能，为复方的新功能开发提供了客观依据［2］。

2 存在问题及展望

2.1 存在问题：①由于人类基因组测序尚未完成，许多基因还不明朗，因此，基因芯片由于所含基因数不全，以致大量的可能有变化的基因漏网，而明显影响到研究结果。正由于如此，在目的类似的DDPCR实验中可以发现许多新的基因片段。②以动物模型为工具进行各项研究，由于此动物 （小鼠、大鼠等）的基因测序工作还没有大面积展开，需要更晚些时候才能完成。③由于哺乳类动物基因组数量大，测同一细胞组织，就目前的基因芯片规模，整个基因组需要许多块芯片，研究工作量和研究成本会很高而且研究费用高昂。④实验数据庞大，且大量的基因功能还不明朗，因此给进一步研究带来困难。⑤基因芯片技术本身存在假阳性率偏高，较严重影响临床应用价值；其次是首先要对标本进行PCR扩增，增加操作复杂性［14］。

2.2 发展前景 虽然有问题存在，但基因芯片技术为生命科学展现出绚丽的前景：①随着人类、大鼠、小鼠，甚至兔、狗、猴等基因组测序完成，将有可能生产出全套基因组芯片，使基因芯片在生命科学、医学等相关领域应用。②当基因芯片生产技术趋于成熟，可能会大批量生产，将有可能降低生产成本，降低售价，易于普及。③一旦类似高效的蛋白芯片技术的解决，与基因芯片的配套使用，将会对生命科学研究取得质的突破。④多学科交叉，各项技术向纵深。例如计算机技术的发展，读片分析自动化程度增加，将使基因芯片技术更加完善、实用。⑤不同基因功能研究的积累，以及基因功能研究技术的发展与普及，使基因芯片研究的后续工作得以有效地开展，基因芯片的科学价值即实用价值将得到充分的体现和迅速发展［1］。

［1］方肇勤.基因芯片技术及其在中医基础实验研究中的应用［J］.上海中医药大学学报，2001，1（15）：17－19.

［2］张发宝，李欣梅.基因芯片技术在中医药研究中的应用［J］.安徽中医学院学报，2002，3（21）：57－59.

［3］托娅，苏秀兰.基因芯片在抗肿瘤血管生成中草药相关基因筛选中的研究［J］.第二军医大学学报，2002，23（3）：273－275.

［4］王兴，任敏.糖肾平胶囊对糖尿病小鼠大血管基因表达的影响［J］.中国天然药物，2005，1（3）：53－55.

［5］王波，李玉.明胰岛素抵抗高血压大鼠基因表达谱和糖脂消对其的影响［J］.介入放射学杂志，2004，12（2）：205－212.

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［7］张小燕，张占军，王忠.栀子苷对局灶性脑缺血大鼠脑组织基因表达谱的影响［J］.中国中西医结合杂志，2005，1（25）：42－44.

［8］王米渠，许景文.中医研究与基因组学及基因芯片技术［J］.江西中医学院学报，2002，3（14）：62－64.

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［12］Pennie Wd.The priciples and practices of toxicogenomics：application and opportunities［J］.Toxicol Sci，2000，4（2）：227.

［13］杨光明，蔡宝昌.分子生物下学技术在中药鉴定中的应用［J］.世界科学技术－中药现代化，2001，4（3）：29－37.

［14］成军.基因芯片技术的原理及其在肝病研究中的应用［J］.中华肝病杂志，2002，4（8）：302.