植物中钙解码机制的研究进展＊

顾志敏，张海良，陈析丰，马伯军

(浙江师范大学 化学与生命科学学院，浙江 金华 321004)

Ca2+作为重要的第二信使，在植物应答光照、极端温度、机械损伤、干旱、盐、植物激素和病原菌激发子等生物和非生物胁迫反应中具有重要的作用［1］.在真核生物中，由Ca2+转运体对细胞质中的钙离子浓度(［Ca2+］)进行严格的调控.正常情况下，细胞质中［Ca2+］保持在低浓度水平(100～200 nmol/L).而在细胞受到某种刺激后，细胞质中［Ca2+］会发生特异性的变化，即产生Ca2+签名(Ca2+signature)［2］.特异性的“Ca2+签名”是借助于细胞内质膜和细胞器膜上的离子通道和转运蛋白产生的［1，3-5］.尽管大量的生理研究表明植物细胞中存在大量的Ca2+转运蛋白［3，6］，但是专门传送Ca2+内流的通道蛋白的分子特性至今仍不清楚.最近研究发现:类环核苷酸门控通道(CNGCs)等非特异性阳离子通道能够提高病原菌防御性信号转导途径中的Ca2+导率［7］;而在花粉管的生长中，类谷氨酸受体蛋白(GLRs)能够介导非特异性的Ca2+内流［8］.这些研究表明，非特异性阳离子通道在Ca2+签名的形成中可能具有重要的作用.

尽管多种环境刺激均可引起细胞质中［Ca2+］增加，产生Ca2+签名，但在不同的刺激下，细胞内［Ca2+］变化的部位和时间特征不同，因此所产生的Ca2+签名也具有特异性.不同的下游反应因子(受Ca2+调控的蛋白质)对Ca2+签名作出反应，称为解码(decoding).环境胁迫不但可诱发植物细胞产生钙信号，而且还可诱导Ca2+传感器蛋白的表达.Ca2+传感器蛋白的激活是Ca2+签名产生后信号继续传递的下游事件，Ca2+传感器参与解码特异性的Ca2+签名，并直接导致特异性生理反应的产生［6］.大部分Ca2+传感器蛋白拥有典型的螺旋-环-螺旋的EF 手型基序，并且成对存在，这些EF 手型基序导致传感器蛋白通过Ca2+依赖型的构象改变而结合Ca2+.研究最多的模式植物拟南芥，其基因组编码了至少250 个EF 手型蛋白［9］.植物中三大类型EF 手型蛋白是:钙调素(CaMs)及类钙调素蛋白(CMLs)、钙依赖型蛋白激酶(CDPKs)和类钙调磷酸酶B 亚基蛋白(CBLs).从概念上来讲，植物Ca2+传感器蛋白作为信号元件可被分成“传感器依赖型”和“传感器响应型”两大类［10］.例如:CDPKs 通过Ca2+传感功能(EF 手型基序)和Ca2+应答功能(蛋白激酶活性)与一个单一蛋白结合，从而被归类为传感器响应型蛋白.因此，这些激酶能将Ca2+签名编码的信息翻译成特定靶蛋白中的磷酸化事件.相反，没有酶催化功能的CaM/CML 家族成员是通过Ca2+依赖型蛋白-蛋白互作改变下游靶蛋白活性的，因此，它们代表着典型的传感器依赖型蛋白.由于缺少一些酶活性，CBL 蛋白也属于传感器依赖型蛋白.但是，CBLs 能特异性地与一种称作CBL-结合蛋白激酶(CIPKs)的激酶家族互作.因此，CBL-CIPK 复合体被看作是双分子传感响应器［11］.下文中笔者将会讨论每个Ca2+传感器蛋白家族的机制和生物学功能.

1 植物中的Ca2+传感器蛋白

1.1 CDPKs 的Ca2+感知和应答

目前研究发现，钙依赖型蛋白激酶(CDPK)仅存在于植物和一些双鞭毛原生生物中［12-14］.拟南芥基因组中有34 个CDPKs.CDPK 由1 个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶域、1 个自我抑制结构域和1 个类CaM 结构域组成，含有4 个EF 手型基序［15］.在正常Ca2+水平下，激酶域的激活部位是通过与自我抑制结构域互作而被抑制的.一旦胞内Ca2+浓度上升，Ca2+结合到类CaM 结构域，使自我抑制结构域被取代，导致激酶激活［16］.CDPKs的这种激活过程大大提高了这些蛋白的自磷酸化，进而促进所有激酶的激活.根据预测，大多数CDPKs 的N 末端被豆蔻酰化和/或S-酰化所修饰，双脂质修饰可以提高这些蛋白的膜附着和膜定位.对蒺藜苜蓿中CPK3［17］和水稻中CPK2［18］的详细研究，揭示了它们的膜定位分别严格取决于豆蔻酰化和S-酰化作用.此外，也证明了其余的CDPKs 定位于包括质膜、内质网膜(ER)和过氧化物膜在内的不同细胞膜上［19-20］.与这些定位研究一致的是各种各样的膜蛋白可以作为CDPKs 的特定底物.在拟南芥中，慢(S-型)阴离子外流通道SLAC1 定位于质膜上，SLAC1 被激酶CPK21 和CPK23 所调节，在植物激素脱落酸(ABA)的应答中调控气孔的关闭.一旦SLAC1与激酶CPK21 和CPK23 共表达，阴离子电流可以显示出2 个蛋白激酶对SLAC1 的刺激.然而，SLAC1 的Ca2+敏感型激活仅仅指向CPK21.因为在体内的磷酸化实验分析中，CPK23 似乎更倾向于对Ca2+不敏感［21-22］.此外，马铃薯中CDPK4 和CDPK5 的磷酸化和质膜上的NADPH 氧化酶RBOHB 的激活导致了活性氧(ROS)的增多［23］.相对而言，Ca2+泵ACA2 定位于内质网膜上是由于拟南芥中的CPK1 通过N 末端的磷酸化而负调控的［24］.明显可以看出，ACA2 是通过与CaMs 的互作被正调控的［25］，表明ACA2 可能是2 种不同的Ca2+信号转导途径的集合点.

最近的研究发现，CDPKs 调节底物的功能似乎不单单局限于膜蛋白.拟南芥中的CPK4，CPK11 和CPK32 磷酸化并正调控脱落酸响应型bZIP 转录因子(ABFs)［26-27］.在烟草中，转录激活子RSG 与由NtCDPK1 调节的赤霉素(GA)信号通路有关.RSG 中Ser-114 的磷酸化使其与14-3-3蛋白互作并且间接导致了RSG 从细胞核进入细胞溶质中［28］.因此，CDPK 介导的磷酸化作用在调节不同的细胞隔间的不同生物过程中起着重要的作用.

1.2 CBL-CIPK 网络系统下的Ca2+感知和应答

CBL-CIPK 信号系统是近年来新发现的钙离子信号识别和传导系统.CBL 蛋白(Calcineurin Blike proteins，简称CBLs)是一类与动物钙调磷酸酶B 亚基(CNB)及中枢神经钙感受器(NCS)极其相似的小分子蛋白，每个CBL 蛋白含有4 个变异程度不等的EF 手型基序［11］.CIPK 蛋白(CBLinteracton protein kinases，简称CIPKs)是CBL 特定靶向的一类丝氨酸/苏氨酸类蛋白激酶［8］.CIPKs 在N 端含有一个与酵母SNF1(sucrose nonfermenting)、动物AMPK(AMP-activated protein kinase)极其相似的激酶催化域(该结构域高度保守)，在C 端含有一个高度变异的调控域，所有CIPK 的C 端调控域均含有一个高度保守的由21 个氨基酸组成的FISL 模体(也称为NAF 模体)，FISL 模体主要用于结合CBL［29］.CBLs 能够感知逆境激发的特异性Ca2+信号，结合Ca2+后与CIPKs 特异性作用，形成CBL-CIPK 复合体，通过翻译后磷酸化下游靶蛋白或调节转录因子及胁迫应答基因，实现不同细胞水平、组织部位抗逆性的调控.

在CBL-CIPK 信号系统中，CBL 蛋白感知Ca2+签名并且与CIPK 激酶中保守的NAF 结构域互作［30］.CBL 结合NAF 结构域释放激酶域的C末端的自我抑制结构域，从而将激酶转变成激活的构象［31］，因此CBL 蛋白的特性决定了CBLCIPK 的亚细胞定位，从而在靶蛋白的识别中产生空间特异性.然而，CBL-CIPK 复合体的底物特异性是由CIPK 决定的.另外，最近的研究发现，CIPKs 与CBLs 互作后，能够以某种机制磷酸化CBLs，这个磷酸化过程对于CBL-CIPK 复合体作用于下游靶蛋白是必须的［32-33］.

CBL-CIPK 复合体的特异性和可选择性，使得拟南芥中一个特定的CBL 可以与26 个CIPKs 中的多个成员互作;反之，一个特定的CIPK 也可以与10 个CBLs 中的几个成员互作.这表明其中可能存在着一个对空间特异性和特异性生理靶蛋白调控的指导原则［34］.例如，酵母双杂交和BiFC 实验分析表明CBL1 与CIPK1 和其他5 个CIPKs 互作，而CIPK1 与8 个CBL 互作［31，35-36］.进一步研究发现:拟南芥CBL1-CIPK1 复合体在干旱和渗透压胁迫应答中发挥作用，而在盐胁迫中没有作用［37-38］;而CBL4-CIPK24 和CBL1-CIPK24 复合体在盐胁迫中起作用［39-40］.

对拟南芥中全部10 个CBLs 的定位分析表明，CBLs 中可变的N 末端对特异性亚细胞定位非常重要［31］.其中，4 个CBL 蛋白定位于质膜上，另外4 个定位于液泡膜上，2 个定位于细胞质和细胞核中［31］.这些不同的亚细胞定位，表明CBL在内部和外部Ca2+储存源的局部Ca2+释放中行使快速继电器的功能，有助于Ca2+信号的空间特异性分布.有意思的是，与CBL 蛋白不同，大多数CIPKs 定位于胞质和核质中［31，39］.然而，体内的CBL-CIPK 互作分析表明CBL-CIPK 复合体中的CIPKs 的亚细胞定位由CBL 的特性决定［31，37，39］.例如:CIPK1 通过CBL1 或CBL9 定位于质膜上［37-38］;而一旦与CBL2 互作，CBL2-CIPK1 复合体则专一性地定位于液泡膜上［35］.在植物的耐盐信号传导中，CIPK24 与CBL4 或CBL10 都能够互作形成不同的复合体，其工作模型是:在根中，CBL4-CIPK24 复合体通过调节质膜上的H+/Na+逆向转运体SOS1 来介导钠离子的外流;而在地上部，CBL10-CIPK24 复合体通过调节未知的靶蛋白将钠离子储存于液泡内［13，41］.

近几年鉴定的一些离子转运蛋白中，很多都属于CBL-CIPK 复合体的靶蛋白.例如，钾离子通道蛋白AKT1 的活性是由CIPK23 在与CBL1 或CBL9 互作的情况下调控的［37，42-43］.有意思的是，在植物中，CBL1/9-CIPK23 复合体不仅调节了钾离子的吸收，也调节了硝态氮的摄取.生物化学和反向遗传学实验结果表明，CIPK23 作为一个关键的调节器，通过磷酸化硝酸盐转运体CHL1 的Thr101 氨基酸残基，介导低和高亲和力的硝酸盐运输模式的转换［44］.

最近，在对钾离子通道蛋白AKT2 的调节作用的研究中，Held 等［45］发现拟南芥中Ca2+传感器CBL4 与它的互作蛋白激酶CIPK6，通过介导钾离子通道蛋白AKT2 转移到质膜上，调节AKT2的活性和膜位置.重要的是，依赖于CBL4 的豆蔻酰化和棕榈酰化的双脂质修饰作用，使CIPK6 中一个独立的C 末端调节结构域介导CBL4 依赖型和Ca2+依赖型的通道从内质网膜迁移到质膜上［46］.因此，这一工作揭示了离子通道调节的一个重要机制:Ca2+传感器通过输送一个互作依赖型而非磷酸化依赖型的激酶转移到质膜上，调节K+通道的活性.

1.3 CaMs/CMLs 的Ca2+感知和传导

在真核生物中，钙调素(CaMs)是保守的Ca2+传感器蛋白.动植物中的CaM 有着高度相似的结构.在拟南芥中，7 种基因编码了4 种CaM 亚型，而亚型的不同仅仅是由于其中1～5 个氨基酸残基的不同所引起的.拟南芥的基因组编码了50 个类钙调蛋白(CMLs)亚型，它们被认为是从原始的CaMs 进化而来的，而现在的CaMs 却表现出高度的结构差异，甚至在EF 手型基序的数量方面也差异很大［47］.CaMs 和CMLs 与Ca2+结合后，它们的构象会发生改变，从而使CaMs 和CMLs 蛋白与它们的靶蛋白发生互作［46，48］.迄今为止，包括激酶、磷酸酶、离子转运体、代谢酶和转录因子在内的许多蛋白已经被鉴定为CaMs/CMLs的靶蛋白［49］.

植物中，CaM 依赖型蛋白激酶(CaMKs)的活性由其与CaM 特异性结合来产生或增强.此外，一些植物中也存在Ca2+-CaM 依赖型蛋白激酶(CCaMKs)，除包含有CaM 结合结构域外，CCaMKs 还含有一个类视锥蛋白Ca2+结合结构域［47］.有意思的是，真核生物中，促分裂素原活化蛋白激酶(MAP 激酶)的偶联和Ca2+/CaM 通路能够交叉.例如，拟南芥的有丝分裂原激活蛋白激酶8(MPK8)需要CaM 的结合与MPK 激酶3(MKK3)的磷酸化作用同时进行，才能全面激活其活性［50］.另外，MPK 磷酸酶1(MKP1)通过与Ca2+依赖型CaM 结合被激活［51］.

CaMs/CMLs 在调节基因表达中也起着重要的作用.例如，有报道指出，拟南芥的CaMK(AtCBK3)和一个CaM 依赖型磷酸酶(AtPP7)分别通过磷酸化作用或去磷酸化作用正调控或负调控 热 休 克 转 录 因 子［52-53］.CAMTAs，WRKYs 和MYBs 等转录因子都是通过与CaMs 直接互作而被调控的［54-56］.值得注意的是，CaMs/CMLs 虽被归类为“传感器依赖型”，但拟南芥的CaM7 似乎本身就有转录因子的功能，CaM7 能够与启动子互作并激活某些光诱导基因［57］.这个发现也提供了一种新的Ca2+信号通路对转录调节的作用模式:CaM7 能够解码细胞质的Ca2+签名后，通过与DNA 结合来调节基因的表达.

2 展 望

Ca2+信号几乎参与了植物生长发育的全过程，因为刺激产生特异性Ca2+签名是Ca2+信号中重要而基本的一步.在过去的十年中，人们对植物中Ca2+解码过程的研究取得了重大的进展.在信息处理的关键步骤中，植物具有一个广泛而复杂的Ca2+结合蛋白工具包，其功能是作为Ca2+传感器来解码各种各样的Ca2+签名.CaMs，CMLs，CDPKs和CBL-CIPK 复合体形成错综复杂的信号网络系统，能够将Ca2+签名转化为磷酸化反应和转录调节等下游反应.正是有了这些重要的解码过程，才使得信息处理过程变得灵活而强大.

现在，我们对于Ca2+传感器蛋白或传感器/激酶复合体的生化特性、生理功能和靶蛋白的认识都有了很大程度的提高，同时，对信号网络系统中信息处理过程的功能性原理也有了认知.然而，目前对Ca2+传感器蛋白精确地感知和传导钙签名的机制仍然不清楚.因此，未来关于钙信号研究的方向有3 个:1)确定不同的转录和调节机制，因为它们负责组装这些不同的信号模块和通路;2)阐明植物中几个独立的Ca2+信号系统形成的原因，以及它们是如何互相联系的;3)阐明植株中Ca2+信号与其他第二信使和激素调节的互作机制.成功地解决这些问题将会极大地推进对植物有机体全面理解的进程.

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