白念珠菌耐药机制新进展

颜钰 曹颖瑛 姜远英

(1.福建中医药大学药学院中药学教研室，福州 350000;2.第二军医大学药学院新药研究中心，上海 200433)

目前对于深部真菌研究最多的是白念珠菌，白念珠菌是威胁人类健康与生命的重要机会致病真菌。随着广谱抗生素、器官移植免疫抑制剂的大量使用、艾滋病患者系统性真菌感染增加，白念珠菌感染及病死率逐年上升。针对白念珠菌病的治疗药物目前仍是以氟康唑、伊曲康唑等唑类抗真菌药物为主导，其次还有多烯类 (两性霉素B)、丙烯胺类(特比萘芬)以及棘球白素类 (卡泊芬净)等。与此同时由于长期大量反复治疗用药以及预防性用药，白念珠菌的耐药现象日益严重。耐药性的产生已经成为临床上治疗失败的主要原因。

白念珠菌的耐药性产生与很多因素有关，目前研究较明确的机制主要包括ATP结合蛋白(ATP-binding cassette，ABC)转运盒多药外输转运子的编码基因CDR过度表达［1］，易化载体超家族(major facilitator superfamily，MFS)基因MDR 1的过度表达［2］，以及麦角固醇合成酶编码基因ERG 11的突变和该酶的过度表达［2］等。随着对于白念珠菌耐药机制研究的不断深入，探索其耐药性也将为今后新型抗真菌药物制剂的问世开辟思路。本文就白念珠菌近年来新发现的耐药机制研究进展作一综述。

1 麦角甾醇生物合成通路与唑类耐药

ERG 3编码甾醇△5，6-去饱和酶，该酶是麦角甾醇合成途径后期阶段的关键酶，能使14-甲基甾醇中间产物转化成细胞毒性的甾醇14-甲基-3，6-二醇，因此抑制该酶的活性，也会产生对唑类药物的耐药［3］。有研究认为在念珠菌和酿酒酵母菌中，ERG 3基因失活后不能生成有活性的甾醇△5，6-去饱和酶，引起真菌细胞内蓄积的甾醇中间产物转变为14-去甲基粪甾醇 (14α-methylfecosterol)，而非14-甲基-3，6-二醇。前者能够部分地代替麦角甾醇的功能，维持真菌生存。而此时由于真菌不能合成麦角甾醇，所以ERG 3基因失活出现对制霉菌素和两性霉素B交叉耐药［4］。

Chau［5］报道的两株临床分离的白念珠菌，它们甾醇成分中的△5，6-甾醇脱氢酶的活性是有缺陷的，与唑类敏感的临床分离株相比，它们在小鼠模型中显示出了较好的减毒作用，同时还能干扰体内真菌菌丝的形成［5］。

2 锌簇转录因子对耐药基因表达的调控

白念珠菌中涉及的锌簇转录因子主要有Tac1p、Mrr1p、Upc2p、Cap1p 等，其中转录因子Tac1p是第1个被发现的能调控白念珠菌耐药基因的转录因子，其转录活化因子在响应诱导性化学物质刺激时，介导着白念珠菌ABC超家族的耐药相关基因CDR 1和CDR 2表达的上调，并且在耐药的白念珠菌中所构成的这些外排泵的过度表达是由于Tac1p功能获得性突变引起的，有研究发现点突变N977D是引起TAC 1基因高活性及产生耐药的重要原因，但其具体机制还有待进一步阐明［6］。

Mrr1p则是白念珠菌中MDR 1表达的核心调节子，不管是在对于外界环境诱导引起MDR 1的表达，或是在耐药菌株中外排泵的过度表达中都是不可或缺的重要因子，Nico Dunkel［7］等人探讨了临床上在其他一些氟康唑耐药的白念珠菌中导致MDR 1过度表达的主要原因，通过对上述菌MRR 1等位基因的测序，MRR 1获得性功能突变体的引入，以及白念珠菌杂合以及纯合的MRR 1等位基因突变体耐药性等的研究，结果显示MRR 1锌簇转录因子确实存在单点突变导致的氨基酸取代。在Mrr1p中的这些氨基酸取代使得转录因子被激活，以及获得性功能突变体的存在伴随杂合子的缺失，都是导致氟康唑耐药白念珠菌MDR 1过度表达的主要原因。

Upc2p来自另一家族的锌簇转录因子，可调控麦角甾醇生物合成基因 (ERG 11)的表达，同时介导着麦角甾醇缺失时相关基因的上调。Nico Dunkel等［8］通过对氟康唑耐药及敏感菌株的ERG 11基因UPC 2等位基因测序，发现分离出的耐药菌株中UPC 2的一个等位基因中一个单核苷酸被取代，从而导致编码蛋白中G648D氨基酸的置换。当敏感菌株中引入突变等位基因时，则会导致ERG 11基因的上调并增加菌株对于氟康唑的耐药性，首次揭示了UPC 2的获得性功能突变体能引起ERG 11基因表达增强，从而也增加对于氟康唑的耐药。

Cap1p是亮氨酸拉链家族的成员，主要在白念珠菌中介导氧化应激反应，最近的研究发现它在白念珠菌细胞内能与耐药相关基因MDR 1的启动子结合，Sadri Znaidi等［9］通过应用广泛基因组定位以及基因表达分析研究显示，Cap1p除了介导氧化应激反应还具有其他细胞内功能，生物信息学序列分析结果表明Cap1p能识别DNA 5＇-MTKASTMA基序，转录组学分析提示Cap1p具有转录激活剂的功能，转录的高表达普遍伴随Cap1p与靶标的结合。

Sabrina Schubert［10］等 人 探 讨 了 Mrr1p 与Upc2p、Cap1p两种转录因子之间是否存在相互依赖关系，以及 Upc2p、Cap1p是否能单独介导MDR 1的过度表达及耐药性的发生，结果表明Mrr1p和Cap1p这两种转录因子与MDR 1启动子结合在某些环境条件下共同介导着MDR 1的表达，从而产生耐药。

另外 Alix T.Coste［11］等还从白念珠菌中分离出与酵母菌中的Pdr1p、Pdr3p功能同源的锌族转录因子的Cta4p、Asg1p和Ctf1p，它们都具有相同的Zn(2)-Cys(6)DNA结合域，结果表明尽管在白念珠菌中Cta4p、Asg1p和Ctf1p与唑类耐药性不相关，但能通过PDRE来激活酵母菌中的PDR 5来介导多效耐药。白念珠菌中Cta4p，Asg1p和Ctf1p的相关功能还有待进一步研究。

3白念珠菌细胞壁在唑类抗真菌药物耐药中的作用

细胞壁是真菌细胞的重要结构，其代谢与真菌生长和分裂密切相关，作用是控制细胞内膨胀压力以维持菌体的完整性，主要含有特殊的甘露聚糖、几丁质和β-葡聚糖成分，其中，几丁质是β-(1，4)连接的 N-乙酰葡萄糖胺 (N-Glc-NAC)的链状聚合物，是细胞壁的支架结构。在白念珠菌细胞壁维持基因中，GPI 1和CWH 8被认为与耐药有关。Armêl Plaine［12］等人通过 Ura-Arg-His基因敲除的方法构建细胞壁相关基因DFG 5、PHR 1、PGA 4、PGA 62等的缺失菌，考察了上述基因缺失菌株细胞壁几丁质含量及β-葡聚糖含量的变化，还观察了细胞壁的形态变化及相关蛋白的表达差异。结果表明，DFG 5、PHR 1、PGA 4和PGA 62基因缺失会降低菌株对卡泊芬净的敏感性。另外，该研究小组还对未知功能的GPI锚定蛋白Pga31p和 Pga62p在细胞壁组成和结构中的作用进行了探讨，研究发现Pga31p蛋白影响细胞壁结构和组成是在细胞壁生物合成早期发挥作用，而与之作用相反的Pga62p蛋白更多的介导了卡泊芬净的耐药。

Keunsook K.Lee［13］等通过比较正常几丁质水平的白念珠菌感染的BALB/c小鼠与高几丁质水平的白念珠菌感染后的小鼠，在感染24 h后，用卡泊芬净治疗的效用。结果显示，在感染早期，前者的治疗效应明显优于后者，并且表现出较少的肾脏损伤。而感染24 h后，后者小鼠的肾脏中能检测到的几丁质含量要高于前者的1.6倍，表明在体外，高几丁质水平的白念珠菌感染后的小鼠对于卡泊芬净的敏感性显著下降。另外，研究还发现，高几丁质含量的细胞在小鼠体内能获得低频率的葡聚糖合酶基因FKS 1突变，该点突变导致了S645Y氨基酸的置换。因此，体内卡泊芬净抗白念珠菌的效力减弱是由细胞壁中几丁质含量的增加或是获得性的FKS 1点突变导致的。

另外，Iuliana V Ene［14］等人探讨了宿主碳源对致病真菌细胞壁结构、药物耐药性以及毒力的影响，主要是通过比较葡萄糖培养的真菌细胞与乳酸培养的细胞二者细胞壁的差别，应用FS-TEM电镜观察了细胞壁的构成、厚度及密度，结合多聚阳离子泄漏的紫外吸收方法考察了细胞壁的理化性质的变化，还比较了它们在渗透压抗性及适应性的影响，以及对于卡泊芬净、两性霉素B、咪康唑等抗真菌药物的敏感性的影响等，与葡萄糖培养的真菌细胞相比，乳酸培养的真菌细胞表现出对卡泊芬净及两性霉素B耐药，而对于咪康唑则更敏感。上述结果表明碳源 (如乳酸、丙酮酸、油酸、氨基酸等)能显著影响白念珠菌对于环境应激的抵抗以及提高对抗真菌药物 (两性霉素B)的抗性;而糖类碳源(如半乳糖、果糖、山梨醇等)则显示出与前者相反的结果。

4 钙调神经蛋白信号传导途径变化及其耐药机制

钙调神经蛋白在白念珠菌中是调控毒力、应激反应和抗真菌药物敏感性的一个关键因子，与酿酒酵母相似，白念珠菌的钙信号途径同样构成一个复杂的网络体系。有研究［15］发现，药物、氧化胁迫、高渗、碱性pH等诸多环境压力能通过某种未知机制，激活白念珠菌质膜CaCehl-CaMidl复合体，引起胞外钙大量内流，胞质钙浓度增加，进而使依赖于Ca2+/钙调素的钙调神经磷酸酶活化，活化的钙调神经磷酸酶能使位于胞质的磷酸化CaCrzlp发生去磷酸化，从而使其进入核内，激活一系列钙依赖性基因的转录。

RTA 2是钙调神经磷酸酶通路中调节白念珠菌对唑类药物耐药性的必需基因，Jia等［16-17］通过构建RTA 2高表达菌株，经过药敏试验，real time RT-PCR、罗丹明6G外排实验、GC高分辨率MS等方法对其机制深入研究，发现RTA 2基因的缺失或者异位高表达能分别增加或降低白念珠菌对唑类抗真菌药物的敏感性，同时RTA 2基因的缺失还能增加二氢(神经)鞘氨醇的蓄积。结论是RTA 2能够参与钙调神经磷酸酶酶介导的唑类耐药以及白念珠菌鞘氨醇长链基的释放。基于以上结果，Jia等［18］作了进一步的研究，通过一系列相应缺失菌株的构建，透射电镜的观察结果以及免疫组化的应用，发现钙激活的钙调神经磷酸酶通过阻断氟康唑对质膜的损伤显著降低了白念珠菌对氟康唑的敏感性，这一过程是通过作用于Rta2p实现的。因此，基于Rta2p在调控氟康唑抗真菌效应时的关键作用，Rta2p有望成为抗真菌治疗的新靶点。

5 蛋白伴侣Hsp90休克蛋白耐药机制

热休克蛋白Hsp90是一种高度保守的分子伴侣，在靶蛋白的折叠、转运、成熟以及降解的过程中起着关键的调节作用。有研究表明，对于人类最普遍的真菌病原体白念珠菌来说，Hsp90介导其对唑类药物的抵抗，而Hsp90的抑制剂则能阻断唑类耐药的产生［19-20］。

Sheena D.Singh［21］等人对于 Hsp90p 在棘球白素白念珠菌耐药方面进行了研究，揭示了介导棘球白素耐药的新机制:Hsp90p抑制后能阻断钙调神经蛋白的激活，遗传性的Hsp90p减少也使得钙调神经蛋白水平下调。在播散性白念珠菌病小鼠模型中，遗传性的Hsp90p表达减少能增强棘白菌素的杀菌效力。钙调神经蛋白是依赖于Hsp90p的棘球白素耐药中的关键介质。

Rebecca S.Shapiro［22］等研究发现，Hsp90p 可调控白念珠菌从酵母态向菌丝态的形态转变，并且Hsp90p调控上述温度依赖的形态学转变是通过抑制Ras1-PKA通路发挥的。毒力实验研究表明，HSP 90基因缺失型白念珠菌对小鼠毒力下降。最近的研究［23］还显示，抑制赖氨酸脱乙酰基酶Hda1p和Rpd3p能阻滞Hsp90p介导的对于常用抗真菌药耐药性的产生和持续，揭示了乙酰化在翻译后阶段调控真菌Hsp90p功能中的作用。

6 生物被膜(BF)的形成及其耐药机制

近些年来，随着医疗技术的日益更新，各种体内人工器械，如人工心瓣膜、静脉插管、导尿管、关节置换术等的应用，使得生物被膜的形成及其耐药备受关注。生物被膜是一种微生物聚集群体，是微生物为适应自然环境有利于生存的一种生命现象。成熟期的白念珠菌生物膜是一个在细胞外基质包裹下的由孢子、菌丝体和假菌丝组成的致密的网状系统，呈有机的三维结构和广泛的空间不均一性。基质和生长环境的不同，生物膜的结构也各不相同［24］。

在生物被膜形成的早期，药物外排泵的表达、质膜中甾醇的组成的变化以及耐药菌株的出现都与白念珠菌生物被膜对唑类药物的耐药相关［25-26］，其他对于日益增加的生物被膜耐药的因素还包括:耐药基因的过度表达 (比如药物外排泵);生物被膜细胞生长速率或代谢速率的改变;药物与胞外基质的结合;以及质膜组分的改变或菌株更强的抗氧化能力出现［27］。

Jeniel Nett［28-29］等人探讨了 β-1，3 葡聚糖在白念珠菌生物被膜耐药中的作用，同时对葡聚糖合酶基因FKS 1在棘白菌素类、多烯类以及嘧啶类抗真菌药物介导的白念珠菌生物被膜耐药中的作用进行了研究，结果表明白念生物被膜细胞壁改变尤其是葡聚糖的变化与耐药性的产生是相关的，但这一过程产生的具体机制还有待更深入的研究。FKS 1影响生物被膜对于其他类抗真菌药物的耐药可能与介导氟康唑耐药具有共同的机制。

Anna Bink［30］等采用咪康唑为模型化合物，探讨了转录因子Efg1在白念珠菌生物被膜体内外对于抗真菌药物耐药中的作用，通过对白念珠菌△efg1 sessile细胞研究，结果表明转录因子Efg1的缺失能提高这些细胞对咪康唑、两性霉素B以及卡泊芬净的敏感性，对氟康唑也有相同的效应;而应用家兔的生物被膜模型，也进一步证实了Efg1在体内介导生物被膜对咪康唑的耐药中的作用。该转录因子有望成为抗真菌药物防治的新靶标。

7 结束语

白念珠菌耐药的分子机制复杂多样，呈现出多靶点多层级水平的变化，针对不同类甚至同一种类的不同种药物，白念珠菌都可能产生与其相应的耐药途径，因此给临床治疗带来了极大的挑战，同时也增加了研究白念珠菌耐药机制的紧迫性及重要性。目前针对白念珠菌治疗方法，各家报道不一，许多抗真菌的新型药物也在不断涌现，但具体疗效还有待进一步研究及探索。而及时准确的诊断，确定适当的用药剂量和疗程，避免盲目的预防性用药及合理的联合用药，研制针对新的作用靶点的抗真菌药物等都能有效地防治耐药性的产生。

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