Wnt调控类风湿性关节炎研究进展

缪成贵，黄 成，黄 艳，李小枫，李 俊

(1.安徽医科大学药学院，安徽 合肥 230032;2.安徽科技学院药学系，安徽 蚌埠 233000)

类风湿性关节炎(rheumatoidarthritis，RA)是一种慢性、系统性、多关节性疾病，发病机制仍不清楚。世界范围内RA发病率为0.5%～1.0%，部分地区高达5%。RA严重影响了病人的生存质量和生命预期，其并发症包括胸膜炎、心包炎、脉管炎等，并可导致死亡，给社会和家庭带来了严重的经济负担［1］。RA发病过程中首先发生病变的是关节滑膜，表现为滑膜的增生和炎症，进而导致骨和软骨的破坏，发病机制目前仍不清楚，但极有可能与关节独特的解剖和生理结构有关。滑膜细胞的激活增生、淋巴细胞的侵入、微血管的生成导致滑膜向软骨表面侵袭增生形成血管翳，破坏骨和软骨的结构和功能［2］。多种信号通路调控了RA的发生发展，其中Wnt通路调控RA发生发展作用的研究起步较晚，但研究证明Wnt通路在RA发生过程中起重要调控作用［3］。在RA发生过程中 Wnt1、Wnt5a、Wnt7b明显高表达，下调 Wnt1、Wnt5a、Wnt7b能够抑制FLS活化增殖，预示Wnt通路相关分子可能是潜在的 RA治疗靶点［4－6］。

1 RA发病机制

关节滑膜衬里层由二到三层巨噬细胞样滑膜细胞和FLS伴较密基质构成，巨噬细胞样滑膜细胞、FLS、树突状细胞、激活的淋巴细胞共同调控抗原的生成，继而诱发了异常免疫应答［1－2］。一般认为抗原诱发的免疫反应导致了B淋巴细胞的分化成熟，形成能够分泌高亲和抗体的成熟B淋巴细胞［7］。虽然没有证据表明何种抗原引发了RA，但各种内源性和外源性抗原在不同程度上引发了该疾病［7］。能被特异抗体结合的自身抗原可能来自于关节组织损伤和细胞凋亡释放的自体固有而未被免疫系统适应的成分。同时能识别IgG Fc段的抗体亦是重要的类风湿抗原。增加的抗原抗体复合物进一步激活了信号瀑布，加重了炎症［1－2］。尽管RA的疾病表现不同，但大多数病人都伴有淋巴细胞不同程度的侵润［1－2］。淋巴细胞的侵入通常是无序混乱的，主要有无规分布于巨噬细胞样滑膜细胞、FLS周边活化的B细胞和T细胞。淋巴细胞的侵入可能进一步增强了FLS的增生和炎症［7］。在大约20%病人的滑膜组织形成囊性生发中心，其中包含来自于血液侵入的淋巴细胞。发生改变的滑膜持续的释放细胞因子、趋化因子、金属蛋白酶、血管生成因子，进而造成软骨的破坏和骨的重吸收［8］。激活的FLS调控了滑膜慢性炎症和骨的侵蚀，在RA的发病机制中起到了重要作用。FLS具有干细胞的增生特性，可能源于关节损伤导致的FLS代偿性再生［9］，部分FLS也有可能来自通过脉管通道自骨髓或直接通过血液循环迁移而来的间质干细胞和基质细胞［10］。增生的FLS释放细胞因子和趋化因子，例如IL-6、IL-8、IL-15、基质细胞起源因子SDF-1等，这些小分子进一步促进了淋巴细胞由血管内向滑膜的迁入、活化。FLS能够合成细胞外基质蛋白，例如纤维连接蛋白、细胞黏附分子，这些分子起到了招募和驻留淋巴细胞的作用，同时FLS可以促进B淋巴细胞分化，分泌基质金属蛋白酶MMP3、基质降解酶(stromelysin 1)，增强了软骨的降解［1－2］。FLS 增强了针对关节软骨降解生成抗原的免疫应答，促进SDF-1和其它内皮细胞生长因子，包括成纤维细胞生长因子FGF、VEGF介导的血管再生。表达于 FLS和 T细胞上的 NF-κB配体(RANKL)与表达于单核细胞上的共用受体RANK相互作用起始了破骨细胞的分化和骨的重吸收［11］，调控了具有破坏软骨的血管翳的形成，造成不可逆的关节损坏。

2 Wnt通路

2.1 Wnt通路组成 Wnt是一种糖蛋白，能够结合Fz胞外区的半胱氨酸富集区，与Fz特异的结合启动了胞内的一系列信号传导途径，上调了细胞的增殖。Fz是一种七次跨膜蛋白，类似于G蛋白偶联型受体。胞外区的N端具有富含半胱氨酸的结构域(CRD)，能与Wnt结合。在辅助受体低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6(LDL 5/6)协同作用下，Frz作用于胞质内的散乱蛋白(Dvl)，散乱蛋白被募集至细胞膜附近，能切断β-catenin的降解途径，从而使β-catenin在细胞质中积累。生理条件下细胞内的β-catenin与Dvl、酪蛋白激酶1(CK1)、axin、腺瘤性结肠息肉病基因蛋白(APC)、肝糖合酶激酶3-β(GSK3-β)结合形成复合物，CK1对 β-catenin的第45位残基进行丝氨酸/苏氨酸磷酸化，此反应又催化了GSK-3β对β-catenin的第41、37和33位残基磷酸化，被磷酸化标记的β-catenin被泛素连接酶β-TrCP蛋白识别进而被泛素化，最后被蛋白酶体介导的泛素化降解，胞质中只表达低水平的β-catenin。Wnt结合Fz后，Dvl被激活后从βcatenin、Dvl、CK1、axin、APC、GSK3-β 大分子复合物上解离下来，导致GSK3-β失活，复合物分解，胞质中β-catenin水平升高并转入核内，与淋巴增强因子/T细胞因子(TCF/LEF)等结合，启动基因转录，上调细胞增殖等效应。内源性的Wnt通路负调控蛋白已经引起人们的重视，这些负调控蛋白可以作为下调Wnt通路的潜在靶点。Fz蛋白的胞外区能够与Wnt对抗蛋白DKK结合，一旦结合发生即可阻断Wnt介导的激活信号［12］。细胞外分泌蛋白SFRPs含有与Fz胞外区相似的区域，可与Wnt蛋白结合阻断Wnt与Fz的特异结合，同样下调Wnt介导的细胞增殖激活信号。一般认为SFRPs是Wnt的负调控蛋白，但又报道表明，在特定情况下，SFRPs也是Wnt蛋白的分子伴侣，保护Wnt蛋白不被降解［13］。

2.2 Wnt通路分类 Wnt通路分为经典通路和非经典通路，划分的依据是信号通路的激活是否依靠β-catenin的活化，大多数关于Wnt通路的研究着眼于 β-catenin介导的Wnt经典通路。在结肠癌中，转入细胞核中的β-catenin上调了myc、cyclin D1等基因，促进了细胞的增殖癌变［14］。在非洲蟾蜍中，转入细胞核中的β-catenin上调了细胞外基质蛋白、纤维连接蛋白，促进细胞的黏附和活化［15］。有证据表明ERK家族激酶能够被Wnt经典通路激活，参与数种细胞分化过程。Wnt非经典通路包括Wnt/Ca2+信号途径和细胞极性通路。Wnt4、Wnt5a、Wnt11能够激活非经典Wnt/Ca2+信号途径，此激活过程通过特定的G蛋白激活磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)，后者水解磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸(PIP2)生成二脂酰甘油(DAG)和三磷酸肌醇(IP3)。细胞膜上的DAG在Ca2+和磷脂酰丝氨酸协助下激活蛋白激酶C(PKC)，PKC作用于细胞膜受体、膜蛋白等相应靶蛋白，使之磷酸化而影响信号传导，例如PKC能上调原癌基因cjun、c-fos表达，诱导细胞增生癌变。IP3是Ca2+通道激活剂，能促进内质网中储存的Ca2+释放到细胞质，同时能开放细胞膜上的Ca2+通道使细胞外Ca2+进入细胞质，导致细胞质Ca2+浓度增加，激活钙调蛋白(CaM)。Ca2+与CaM结合后形成Ca2+/CaM复合物激活下游效应蛋白-CaM激酶，通过级联反应引起广泛的生物学效应。细胞极性通路前半部分与Wnt经典通路完全相同，不同点在于Dvl处。Dvl由保守区域DIX、PDZ和DEP组成，DIX和PDZ参与经典Wnt通路，只有DEP参与细胞极性通路的激活，例如Wnt7a与Fz受体结合能够激活细胞极性通路，其下游激活的靶基因包括Dsh、VanGogh、prickle、Strabismu、diego 和 flamingo 等［16］。

2.3 Wnt蛋白合成 大多数Wnt蛋白大小40ku，含有350个左右的氨基酸残基，具有相似的分子结构。不同物种间有约23～25个半胱氨酸残基高度保守［17］。Wnt蛋白N端的疏水性信号序列有助于Wnt蛋白向内质网转运。在内质网中未成熟的Wnt蛋白通过不同途径进行转录后修饰成为成熟Wnt蛋白。首先，内质网中未成熟Wnt蛋白可以发生糖基化修饰。未成熟Wnt蛋白在寡糖基转移酶(oligosaccharyl transferase complex，OST)复合物的催化下将N连接寡糖链连接于Wnt蛋白骨架中合适的氨基酸残基上，使之糖基化。Wnt蛋白N端糖基化的作用尚未完全阐明，有研究表明小鼠Wnt1潜在糖基化位点的部分或完全变异并未影响其功能［18］。其次，未成熟蛋白在内质网中可以发生棕榈酰化。棕榈酰化的具体功能也未完全阐明，可能的功能是疏水的棕榈酰基团促进Wnt蛋白向内质网膜移动，促进OST复合物糖基化未成熟Wnt蛋白。同时棕榈酰化对Wnt蛋白的功能也有重要影响，例如Wnt3a在去除棕榈酰基后功能也同时丧失［17］。Porcupine蛋白是膜结合的 O-酰基转移酶(membrane-boundO-acyltransferase，MBOAT)家族的一员，内质网内的Porcupine蛋白在Wnt蛋白糖基化和棕榈酰基化过程中均有作用。缺乏porcupine导致寡糖链不能黏附，过度表达porcupine导致Wnt蛋白异位糖基化［17］。Porcupine结合Wnt蛋白可能影响Wnt蛋白的构象，有利于Wnt蛋白的糖基化和棕榈酰化［19］。

2.4 Wnt蛋白分泌 成熟的Wnt蛋白由内质网转运至高尔基体反面的网络结构，再通过不同的亚细胞结构释放。成熟功能性Wnt蛋白可以通过bulk flow途径分泌，经未调节分泌小泡离开表达细胞。有研究表明细胞中内涵体小室、内涵体与质膜之间的循环小泡含有Wnt蛋白［20］。这些成熟Wnt蛋白可能来自于分泌细胞分泌后再内吞或分泌前经某种机制导入到这些亚细胞结构。Wnt蛋白分选进入不同亚细胞结构是Wnt蛋白成熟的关键步骤之一，可能会影响到信号转导的范围。尽管多数研究显示Wnt蛋白通过细胞外的可控扩散方式到达目标区域，但Wnt蛋白的释放后迁移是通过细胞外的可控扩散还是直接的跨细胞方式到达目标区域一直存在争议［21－22］。Pankovd［23］等研究发现脂蛋白颗粒对Wnt蛋白的远距离信号转导是必需的，但对近距离的信号转导没有明显影响，提示脂蛋白对Wnt的分泌有一定的作用。Wntless(Wls)是一个7次跨膜，能与Wnt相互作用的高度保守蛋白，Wnt蛋白表达Wls下调时，Wnt蛋白滞留在其分泌细胞内，提示Wls对Wnt蛋白的分泌至关重要［24］。Retromer是一高度保守的多蛋白复合物，其核心包含Vps35、Vps29及Vps26亚基。缺失核心蛋白Vps35后线虫内的EGL-20/Wnt信号传导丧失［25］。同样在哺乳动物细胞和非洲爪蟾中敲除Vps35能够阻断Wnt目标基因的表达。提示Retromer蛋白对Wnt蛋白的分泌发挥了重要作用［26］。

2.5 Wnt调控骨的形成和骨的重吸收 研究证明Wnt信号通路通过调控造骨细胞和破骨细胞的增殖分化增加了骨的形成。造骨细胞祖细胞敲除β-catenin后抑制了表达骨钙素的造骨细胞的分化。另外Wnt信号可以促进造骨细胞osteoprotegerinin的上调表达，因为osteoprotegerinin可以抑制破骨细胞的分化，Wnt信号可以部分通过抑制破骨细胞介导的骨的再吸收增加骨的密度［27］。Dickkopf家族蛋白、Wise蛋白和sclerostin蛋白等在调控骨的形成和骨的再吸收过程中发挥了重要的作用，调控了Wnt/β-catenin通路激活。这些蛋白能够与Wnt、Fz、LRP5和LRP6结合激活或者抑制通路活性［28］。DKK1是Wnt/β-catenin通路的可溶性抑制蛋白，通过结合到Wnt共受体LRP5抑制Wnt通路活性。增加的DKK1水平增加了骨的再吸收，减少DKK1水平增加了骨的形成。LRP5突变导致高骨密度为特征的综合征，雌激素和糖皮质激素缺乏介导的骨质疏松症很有可能与造骨细胞DKK1的激活有关［29］。在C57BL/6J小鼠中转染arthritogenic K/BxN制备鼠关节炎模型，炎症控制后骨的重吸收停止，造骨细胞介导骨形成，修复侵蚀骨。同时炎症控制后伴随明显的Wnt通路改变，即在炎症控制阶段Wnt负调控基因SFRP1、SFRP2表达下调，Wnt10b表达上调了，说明炎症调控了Wnt通路，同时说明Wnt通路对造骨细胞介导的软骨修复是至关重要的［30］。

3 Wnt调控RA机制

Wnt通路调控细胞增殖分化、细胞的癌变、肿瘤的侵袭生长等，与肿瘤的发病机制密切相关，在在膀胱癌、胃癌、宫颈腺癌、肝癌、肾癌、结肠癌等各种癌组织细胞中均高表达Wnt蛋白和Wnt通路相关分子。Wnt通路调控RA发病机制研究起步较晚，但近几年此方面研究取得重要进展，并证明Wnt通路在调控RA发生发展过程中起重要作用。与正常成人滑膜组织相比，Wnt和 Fz同源分子，例如 Wnt1、Wnt5a、Wnt7b和Fz5，在RA病人滑膜组织中明显高表达，并且Wnt1、Wnt5a高于炎症较轻为特征的骨关节炎，提示Wnt1，Wnt5a和Fz5的高表达可能与炎症程度有关［4-6］。在RA病人关节FLS中同样检测到了Wnt1，Wnt5a和Fz5的高表达，进一步验证了Wnt1，Wnt5a和Fz5与RA密切相关。但实验证明同样的Wnt/Fz表达持续时间与增加的细胞因子并没有直接的量化关系，说明炎症对Wnt/Fz的影响可能在Wnt通路的上游，即 Wnt通路负调控基因 SFRPs、DDKs等［4－5］。SFRPs作为Wnt的负调控蛋白分子在 RA 滑膜组织和FLS中都有表达，即RA特异的疾病内环境诱导了SFRPs的差异表达。SFRPs与炎症因子及SFRPs与RA发病机制的关系有待于进一步研究证实。

3.1 Wnt1调控RA发生过程 TCF报告基因分析，Wnt 1诱导FLS的Wnt通路激活，上调前MMP3和纤维连接蛋白的表达。FLS中Wnt 1介导的信号刺激了前MMP3的合成，在非RA FLS中转染Wnt 1表达载体上调了前MMP3，采用抗Wnt 1抗体或重组SFRP1抑制了其合成。RAFLS转染dn LEF1或dn TCF4后前MMP3的水平没有明显变化，说明前MMP3的合成不是通过经典的Wnt/LEF/TCF途径。因为前MMP3基因启动子有AP1结合位点，很有可能Wnt 1介导的前MMP3合成是通过JNK介导AP1转录因子家族［4－5］。转染TCF4和LEF1变异载体的FLS能够抑制纤维连接蛋白的合成，抗Wnt 1抗体和SFRP1能够起到同样的作用，说明Wnt1在FLS中通过LEF/TCF途径调控了纤维连接蛋白的表达。纤维连接蛋白是一个多功能蛋白，不仅能起到存活细胞的作用，还能促进整联蛋白(integrin)介导的细胞黏附作用。纤维连接蛋白是强有力的成纤维细胞诱导物，能够促进FLS的存活，能够促进RA滑膜中间质干细胞和白细胞的合并、保留，甚至在缺少前炎症因子的情况下促进增生。FLS中Wnt 1介导的信号增加了前MMP3分泌增加了成熟MMP3的合成，加重了关节软骨的破坏。Wnt1诱导信号通路蛋白3(WISP3)在RA滑膜中表达比骨关节炎病人或者没有风湿病的对照病人高，WISP3在体外被前炎症细胞因子诱导表达，其多态性与青少年多关节先天性关节炎的易感性相关［4］。

3.2 Wnt5a调控RA发生过程 Wnt5a调控了RA的发生过程。Wnt5a和Fz5的特异结合上调了血管内皮生长因子VEGF，促进了滑膜组织新生血管的生成，促进滑膜的增殖。Wnt5a和Fz5的特异结合调控了炎症因子的释放，促进了白细胞自滑膜微血管向滑膜组织的迁入和活化，例如趋化因子SDF-1在Wnt5a激活Wnt通路后表达上调。抗Fz5血清处理RA FLS导致了RANKL的表达下调，说明Wnt5a同样参与了软骨的侵蚀和骨的吸收。转染正常FLS Wnt5a表达载体上调了细胞因子、趋化因子(IL-6，IL-8和IL-15等)的表达，转染RA FLS反义Wnt5a或负调控Wnt5a载体下调了上述分子的表达。Dn-Wnt5a在细胞表面与Wnt5a受体结合阻断了Wnt5a与其对应Fz受体结合，下调了Wnt5a激活Wnt通路的作用，抗Fz5血清处理细胞后细胞因子、趋化因子的表达同样下调了。抗Fz5血清与Fz5结合后特异封闭了Wnt5a与Fz5的亲和，证明Wnt与Fz的结合是有选择性的、特异的，预示不同Wnt与Fz的结合可能产生不同的生物效应。Wnt受体Fz5在Wnt5a激活Wnt信号通路的过程中起到了协同作用，Wnt5a通过自分泌或旁分泌的形式或两种形式兼有的方式结合在Fz5上，但不排除Wnt5a与Fz5相互独立的合成最后以汇合的方式结合在滑膜细胞表面［4－5］。

3.3 Wnt7b调控RA发生过程 Nakamura等［6］采用原位杂交和免疫组化方法分析发现在RA关节软骨、骨和滑膜中均高表达Wnt7b，当向RA滑膜细胞转染Wnt7b后前炎症细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6表达上调了，这些因子在RA的发病机制中占重要作用，说明Wnt7B调控了RA的发生过程。

4 Wnt通路是潜在的类风湿性关节炎治疗靶点

Wnt通路在器官发育、软骨形成、骨的吸收和肿瘤发生中发挥重要调控作用，目前研究证实Wnt通路调控了RA的发生过程，在RA发生过程中Wnt1、Wnt5a、Wnt7b明显高表达，上调了MMP3、纤维连接蛋白、细胞因子等表达，促进FLS活化增殖、滑膜增生、血管翳、新生血管的生成等，在RA发生发展中起重要作用。本课题组采用福氏完全佐剂制备SD大鼠RA模型并鉴定，造模后股动脉放血处死大鼠，分离膝关节滑膜组织，组织块法贴壁原代培养FLS并鉴定，RT-PCR、Western印记法、免疫组织化学法检测 SFRP1、MeCP2在对照大鼠和模型大鼠组织、FLS中的表达差异，RT-PCR、Western印记法检测甲基化抑制剂DAC(5-氮杂2-脱氧胞苷，5-AzadC)、MeCP2 siRNA对RA模型大鼠FLS SFRP1表达上调的作用。通过研究发现与正常对照大鼠相比，RA模型大鼠膝关节滑膜组织SFRP1表达明显下调，β-catenin表达明显上调，说明在RA模型大鼠关节滑膜组织中，Wnt通路是激活的。同时在滑膜组织中MeCP2表达明显增高，预示在大鼠膝关节组织病变过程中发生了SFRP1基因的甲基化。在RA模型大鼠FLS同样存在SFRP1表达下调，Wnt经典通路关键基因β-catenin表达上调现象，对FLS使用甲基化抑制剂DAC后，SFRP1表达不同程度上调，β-catenin表达不同程度下调，进一步说明在病变过程中发生了SFRP1基因甲基化，并且病变过程激活了Wnt经典通路。同时伴随SFRP1表达的恢复，促凋亡基因Bax、Caspase-3表达明显升高，说明甲基化修饰导致SFRP1表达恢复，促进过度增殖的滑膜细胞凋亡。通过调控Wnt通路相关分子表达能够调控Wnt通路活性和RA的发生发展，预示Wnt通路相关分子能够作为RA潜在的治疗靶点，此方向的进一步研究有利于RA的临床诊断和治疗。

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